| 研究概要 |
若年性歯周炎原因菌のActinobacillus actinomycetemcomitansは通性嫌気性菌で、酸素のある環境においても生育可能である。当該研究では、本菌のエネルギー産生機構およびその生理的な役割を分子生物学的に解明することを目的として解析を行っている。現在までに、A.actinomycetemcomitansに存在する好気的な電子伝達系(呼吸鎖)を同定し、さらにその構成成分であるNADH脱水素酵素の精製を行い、現在クローニングが進行中である。今回さらに、呼吸鎖の末端酸化酵素の精製、およびその性質を検討した。細菌の末端酸化酵素はチトクローム酸化酵素とキノール酸化酵素の2つに分けられるが、本菌はチトクロームcを酸化する活性はもっておらず、キノール(ubiquinol-1)を参加する活性のみを有していた。そこでまず本菌ATCC29522株を果糖添加培地で培養し、対数増殖機で集菌後、超音波破砕膜小胞を調製し,これよりubiquinol-1酸素酸化還元酵素活性を指標としてキノール酸化酵素を精製した。まず膜小胞からの可溶化は0.5%sucrose monolaurate(界面活性剤)で行い、以降同界面活性剤存在下精製を進めた。DEAE Sephacelカラムで分離した後、ハイドロキシアパタイトカラムにより完全精製した。精製酵素の活性は特異的な阻害剤であるKCNによって完全阻害された。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動より分子量が50Kと29Kの2種類のサブユニットから成ることが明らかになった。また,ゲルろ過より求めた未変性酵素の分子量は85Kであり、このことより本酵素はnativeな状態では上記2種のサブユニット各1個より成る2量体として存在していることが示唆された。精製した酵素の酸化還元差スペクトルには636nm,595nm,556nmの吸収極大が認められ、SDS-PAGEのパターンとも合わせて考えるとチトクロームbd型の酸化酵素である可能性が強く示唆された。遺伝子のクローニングをするために現在、酵素の部分アミノ酸配列を決定中である。
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