| 研究課題/領域番号 |
09671896
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
上野 明道 徳島大学, 歯学部, 助教授 (80136267)
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| 研究分担者 |
三輪 佳宏 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (70263845)
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| キーワード | トロンボスポンジン / 石灰化 / 細胞外基質タンパク質 / MC 3T3-E1細胞 / Stable transformant / von Kossa 染色 / Lac Swich / IPTG |
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| 研究概要 |
従来型のLac Switich誘導型哺乳類細胞発現型ベクターは、Lacレプレッサーの発現量が少なく抑制漏れによるバックグラウンドが高かったので、F9-1ポリオーマプロモーターをCAGプロモーターに変換した。MC3T3-E1細胞にその変換したpCAG-LacIプラスミドをドランスフェクションし、ハイグロマイシン耐性のStable transformantを24株分離した。その中からウェスタン・ブロティングによりLacレプレッサー高発現株5株を選択した。その単離細胞株の石灰化能をvon Kossa染色により定量したところ、野生株に近いのは1株のみであった。
pOPRSV-CATプラスミドからAmp耐性遺伝子、CAT遺伝子を削除し、マウストロンボスポンジン1(mTSP1)CDNA(4.3kb)を挿入し、ORFがin frameで入っていることを塩基配列の決定により確認した。上記LacI安定発現株にpOPRSV-mTSP1をリポフェクションして、G418耐性により選別してmTSP1誘導は告げんか部を4つ得た。その中からIPTG添加により7時間後にTSP1の発現が最も強く誘導される1株を選択した。この細胞株(iTSP1-MC3T3-Lac)は、約3週間でvaon Kossa染色により検出されるノジュールを形成した、IPTG添加によりTSP1の発現を誘導すると用量依存的に石灰化を抑制した。誘導時期を変化させるために、細胞生着直後から24時間おきに8時間ずつIPTGに接触させた。その結果10日目までは、TSP1発現により有意な石灰化能の低下を示したが、バラツキが大きく時期依存性については明瞭な結果は得られたかった。また、14日目以降にIPTGを添加しても効果は認められなかった。以上より、TSP1の抑制効果は、sub-confluentとconfluent直後が、最も大きいことが示唆された。
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