細胞死モデルとしてのカテプシンE遺伝子過剰発現細胞の分子細胞生物学的研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09671897
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 堀 信顕 九州大学, 歯学部, 助教授 (60037520)
• 研究分担者: 中西 博 九州大学, 歯学部, 助手 (20155774) ; 山本 健二 九州大学, 歯学部, 教授 (40091326)
• キーワード: カテプシンE / 細胞内アスパラギン酸プロテアーゼ / PC19細胞 / 細胞死モデル / 神経細胞 / 遺伝子導入 / 分化誘導

研究概要

最近、ニューロン死機構におけるプロテアーゼの細胞死実行因子としての重要な機能が次第に明らかにされており、神経障害に伴って活性化あるいは発現増大する神経細胞およびグリア細胞の細胞内プロテアーゼに注目した研究が報告されるようになっている。本研究では、神経障害に伴い神経細胞ならびにミクログリア細胞内に発現増大するカテプシンEの機能を解析するために、本酵素を過剰発現させた神経細胞モデルを作成し、様々な細胞死シグナルによる性状変化を解析した。ヒトカテプシンEのcDNAより発現プラスミドを作成し、これを未分化ならびにレチノイン酸で神経細胞に分化させたPC12細胞にリン酸カルシウム法により移入した。未分化ならびに分化細胞におけるカテプシンEの局在様式および分子型を免疫組織学ならびにイムノブロティング法で解析した。その結果、いずれの場合もカテプシンEは小胞体分布様式を示し、プロ型分子で存在していることが示された。一方、ラット脳から分離精製した初代培養ミクログリア細胞をインターフェロンg/LPS処理によって活性化するとカテプシンEの著しい発現増大が見られ、本酵素はエンドソーム様コンパートメントに局在することが免疫電顕観察からしめされ、成熟型の活性酵素であることが示された。神経細胞に分化させたPC12細胞を活性化ミクログリアで処理すると、PC12細胞のみに細胞死が誘導された。両細胞を直接接触しない形での共存培養や活性化していないミクログリア細胞を加えた場合はPC12細胞に細胞死は誘導されなかった。この細胞死に対して種々のプロテアーゼインヒビターの影響を調べた結果、PC12細胞ではカスパーゼインヒビターが、ミクログリア細胞ではカスパーゼインヒビターとペプスタチンやロイペプチンなどのエンドソーム・リソソーム蛋白分解系阻害剤が阻害することが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Fujise N. et al.: "Distribution of calretinin immunoreactivity in the mouse dentate gyrus: II. Mossy cells, with special reference to their dorsoventral difference in calretinin immunoreactivity." Neurosci.82. 180-200 (1998)
• [文献書誌] Shihara M., et al.: "Endotherin-1 increases the neuronal activity and augments the resonse to glutamate in the NTS." Am. J. Physiol.275. R658-R665 (1998)
• [文献書誌] Saito R., et al.: "Anti-emic effects of a novel NK-1 receptor agonist HSP-117 in ferrets." Neurosci. Lett.254. 169-172 (1998)
• [文献書誌] 右田啓介、その他: "バソプレシンによる最後野から弧束核への神経調節." 日本薬理学雑誌. 112. 148-152 (1998)
• [文献書誌] Migita K., et al.: "Effects of arginine vasopressin on the neuronal interaction from the area postrema to the nucleus tractus solitarii in rat brain slice." Neurosci. Lett.256. 45-48 (1998)
• [文献書誌] Nakayama K. et al.: "A hemoglobin receptor protein intragenetically encoded by the cysteine proteinase-encoding genes and the hemagglutinin-encoding gene of Porphyromonas gingivalis." Mol. Microbiol.275. 51-61 (1998)
• [文献書誌] Abe N., et al.: "Biochemical and functional properties of lysine-specific cysteine proteinase (Lys-gingipain) as a virulence factor of Porphyromonas gingvalis." J. Biochem.123. 305-312 (1998)
• [文献書誌] Sastradipura D.F., et al.: "Identification of cellular compartments involved in processing of cathepsin E in primary cultures of rat microglia." J. Neurochem.75. 2045-2056 (1998)
• [文献書誌] Okamoto K. et al.: "Involvement of lysine-specific cysteine proteinase in hemoglobin adsorption and heme accumulation by Porphyromas ginggivalis." J. Biol. Chem.273. 21225-21231 (1998)
• [文献書誌] Kadowaki T., et al.: "Arg-gingipain acts as a major processing enzyme for various cell surface proteins in Porphyromonas gingivalis." J. Biol. Chem.273. 29072-29076 (1998)
• [文献書誌] Takai, N. et al.: "Involvement of caspase-like proteinases in apoptosis of neuronal PC12 cells and primary cultured microglia induced by 6-hydroxydopamine." J. Neurosci. Res.54. 214-222 (1998)
• [文献書誌] Tominaga, K. et al.: "Excitotoxin-induced neuronal death is associated with response of an unique intracellular aspartic proteinase cathepsin E." J. Neurochem.71. 2574-2584 (1998)
• [文献書誌] Nakanishi, H. et al.: "Hyperexcitability of amygdala neurons of senescence-accelerated mouse P10 revealed by electrophysiological and optical recordings in an in vitro slice preparation." Brain Research. 812. 142-149 (1998)
• [文献書誌] 山本健二、その他: "歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisが産生するシステインプロテアーゼの機能" 炎症. 18. 259-264 (1998)
• [文献書誌] 中西 博、山本健二: "神経細胞およびミクログリアのプロテアーゼを介したニューロン死の制御." 日本薬理学雑誌. 112. 77-78 (1998)
• [文献書誌] Fukuda, T. et al.: "Novel non-apoptotic morphological changes in neurons of the mouse hippocampus followin transient hypoxic-ischemia." Neurosci. Res.(in press). (1999)
• [文献書誌] Wang, H. -D. et al.: "Differential effect of Bcl-2 overexpression on hippocampal CA1 neurons and dentate granule cells following hypoxic-ischemia in the adult mice." J. Neurosci. Res.(in press). (1999)
• [文献書誌] Nakanishi H., and Yamamoto K.: "Cathepsin E in the central nervous system. Aspartic Proteinases (Ed: James M.N.G)" Plenum Press, New York, 213-217 (1998)