| 研究概要 |
SNARE仮説は開口分泌のメカニズムを説明する現在最も有力な仮説であるが、この仮説が外分泌細胞にも適用できるという確証はまだ得られていない。SNARE仮説では分泌顆粒膜と細胞膜にv-SNARE,t-SNAREとよばれる受容体蛋白質が存在し、それらが複合体を形成することで両膜がドッキング・融合すると考えられている。Syntaxin-4とSNAP-23がt-SNAREとしての機能を備えているかどうかを検討した。
1. VAMP-2、Syntaxin-4、SNAP-23の相互作用
ラット脳と耳下腺腺房細胞からLysateを調製し、VAMP-2、Syntaxin-4、SNAP-23に対する特異抗体を用いて免疫沈降反応を行った。その結果、脳ではVAMP-2抗体によってSyntaxi-1とSNAP-25が共沈し、SNARE複合体の形成が確認された。しかし、耳下腺細胞ではVAMP-2抗体でSyntaxin-4、SNAP-23が共沈することも、逆に、Syntaxin-4、SNAP-23に対する抗体でVAMP-2が沈降することもなく、Syntaxin-4、SNAP-23がt-SNAREであるという証拠は得られなかった。ただし、Syntaxin-4抗体はSNAP-23を共沈させ、両者の相互作用は確認された。
2. VAMP-2抗体によって免疫沈降するタンパク質
VAMP-2抗体によって免疫沈降する成分を明らかにするため、耳下腺細胞の粗分泌顆粒画分をビオチン化し、VAMP-2抗体による免疫沈降物をアヴィジン・ビオチン法により検出した。その結果、VAMP-2抗体はVAMP-2の他に80kDaと35kDaのタンパク質を特異的に沈降していた。これらのタンパク質はVAMP-2に結合し、VAMP-2とt-SNAREの結合を調節している可能性が示唆された。
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