| 研究課題/領域番号 |
09671916
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
小野 貢伸 北海道大学, 歯学部附属病院, 助手 (50281829)
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| 研究分担者 |
吉田 幸一 札幌医科大学附属がん研究所, 講師 (60117653)
進藤 正信 北海道大学, 歯学部, 助教授 (20162802)
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| キーワード | 転写因子 / E1AF / がん細胞 / 細胞同期 |
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| 研究概要 |
1.メタロチオネン誘導E1A-F発現ベクターの構築
E1AFcDNAの開始コドンを含むcDNAのEcoRI領域(1.7kb)をpBluescriptKSにサブクローニングし、これをEcoRVで切断し、BamHI linkerを結合した断片をメタロチオネンプロモーターを有する真核細胞発現ヴェクターpSVneoHMT-TerのBAmHI siteに挿入し、真核細胞への発現ベクターphMTII E1AFを構築した。
2.細胞への遺伝子導入とセレクション
ヌードマウス舌に移植すると浸潤性の腫瘍を形成し、Raft cultureにおいてもゲル中へ浸潤し、E1A-FmRNA、MMPの発現の顕著な細胞株である口腔扁平上皮がん由来細胞HSC3とE1A-FmRNA、MMPの発現がほとんどみられず、膨張性発育を示す細胞株である口腔扁平上皮がん細胞株Ca9.22にphMTII E1AFをリポフェクション法で遺伝子導入した。発現ベクターpSVneoHMT-Terにはネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれているので、G418(ネオマイシン)によるアンチセンス導入細胞のセレクションを行った。遺伝子導入後、約4週間で、各々80個と60個のネオマイシン耐性クローンが得られた。メタロチオネン誘導発現ヴェクターは培養液中にZn^<2+>を加えることにより挿入遺伝子の発現を促すことが可能であるため、培地中に100μMの濃度でZnCl_2を加え、12時間後にRNAを回収し、E1A-FmRNA発現の有無をNorthern blot法で検索した。こうして、安定した発現のみられる細胞株を確立した。
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