| 研究概要 |
化学発癌剤4-nitroquinoline 1-oxide(4NQ0)を用いて誘発したラット舌癌の発生過程におけるp53遺伝子の変異の検討を行った.実験方法として,50ppmの4NQ0を12週間投与し,投与開始後0週,4週,8週,12週,16週,20週,24週で舌を採取し,4%PFAで固定した後,パラフィン切片を作成した.組織学的には4NQ0投与開始後8週から舌根部に過形成上皮,12週から異型性上皮が出現し始め,16週ないし20週を過ぎたころから初期の発癌が見られた.p53遺伝子の検索として,各標本の10μmパラフィン切片を10枚マイクロチューブにとり,タカラDexpatを用いてゲノムDNAを抽出した.これを鋳型とし,PCRを用いて各エクソン(exon5,6,7,8)ごとにホットスタート法で増幅を行った.first PCR 40 cycle,second PCR 30 cycleを行った後,試料をアガロースゲル上に5μlずつ電気泳動し,エチジウムブロマイドで発色して,増幅を確認した.その結果,今回設計したプライマーで十分な増幅が行えることを確認した.次に,SSCP法としてPCR反応液をホルムアミド存在下で80℃,5分間加熱し,そのまま室温で冷却した.DNAを一本鎖に解離した後,低温下でポリアクリルアミド電気泳動を行った.泳動終了後ゲルを銀染色し,各エクソンにおける変異の有無を調べた.現在,0週,4週,8週,12週,16週,20週,24週のラットについて各週齢3例ずつ,SSCP法でp53エクソン5,6,7の変異を検索したところ,まだ遺伝子変異の確証は得ていない.今後はラットの数を増やし,変異時期を確認する予定である.
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