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(1)カルコン合成酵素の大量調製
クズ培養細胞からクローニングしたカルコン合成酵素のcDNAを発現ベクターに組込み、大腸菌に導入した。発現を誘導し、大量のカルコン合成酵素を大腸菌に作らせ、カルコン合成酵素を調製した。
(2)スチルベン合成酵素の大量調製
既に報告されているピ-ナツのスチルベン合成酵素のcDNAの塩基配列を基には、プライマーを合成して、ピ-ナツのcDNAを鋳型にPCRを行い、ピ-ナツのスチルベン合成酵素のcDNAを得た。このスチルベン合成酵素のcDNAを用いて、カルコン合成酵素と同じ様に大腸菌に作らせ、スチルベン合成酵素を大量に調製した。
(3)還元酵素の大量調製
既に報告されている大豆の還元酵素のcDNAの塩基配列を基に、スチルベン合成酵素同様に、プライマー合成し、クズcDNAを鋳型にPCRを行い、クズの還元酵素のcDNAを得た。このクズの還元酵素のcDNAを用いて、カルコン合成酵素と同じ様に大腸菌に作らせ、還元酵素を大量に調製した。
(4)スチルベン合成酵素の反応機構の解析
大腸菌で発現した酵素を用いて反応を行い、生成物を液クロで分析したところ、これまで、非最適条件下のカルコン合成酵素の反応において副生成物として同定されていたビスノルヤンゴニンが、スチルベン合成酵素の反応においては、最適条件下においても比較的大量に生成していることが判明した。また、クズ由来の還元酵素とピ-ナツ由来のスチルベン合成酵素を同時にインキュベートしても、還元された生成物(ヒドラゲン酸)が検出されず、これら二つの酵素は協同作用しないことが判明した。
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