| 研究課題/領域番号 |
09672194
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
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| 研究分担者 |
鈴木 榮一郎 味の素(株), 中研, 主席研究員
栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575)
黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204)
野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
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| キーワード | タンパク質 / リフォールディング / ル-スフォールディング |
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| 研究概要 |
(1)Hen egg white lysozymeの4つのS-S結合をDithiothreitolにより全還元して6M Guanidinium chloride(GdmCl)に溶解した状態からS-S結合再酸化を含むRefolding操作を行った。上記の変性状態から単純希釈法により10μMのLysozyme濃度にして還元型および酸化型GliutathioneよりなるRedox系を作用させると約20%活性回復するが残りは殆どがAggregationを起こしてしまう。GdmClを0.5〜1M共存させ、タンパク質分子をLoose folding状態にして再酸化すると活性回復率は80%にまで飛躍的に上昇した。さらに、GdmClの働きをUreaとLiClの作用を組み合わせた働きととらえ、この2つの試薬の濃度を様々に変えた溶液を調製し、それぞれの溶液でRefoldingを行った。UreaとLiClの濃度を縦、横軸にとり、2日後に測定した活性回復率をパラメーターとした等高線表示によりUrea-LiCl組み合わせ溶液によるLysozymeのRefoldingに対する特性図を作成した。その結果、Urea濃度が2〜4M、LiCl濃度が0.5〜3Mのかなり広い領域で活性回復率はほぼ100%達成できることがわかった。UreaとKClおよびUreaとNaClの組み合わせ溶媒を使ってのRefoldingも行いこれらについても特性図を作成した。
(2)Lysozymeと同様4つのS-S結合をもつBovine pancreatic ribonuclease A についてもUrea-LiCl系によるRefolding特性図を作成した。(1)の場合とはかなり異なり、この場合は何も試薬を添加しない方が活性回復率が高く現れた。このタンパク質分子は水との相互作用のみでRefoldingできる理想的なアミノ酸配列と、疎水性、親水性、イオン性などの各種相互作用を司る部位が理想的に分布していると考えられ大変興味深い。
(3)Lysozymeの濃度を様々に変えてUrea-LiCl系でRefoldingを行わせ、これらについても特性図を作成した。活性回復率の高い領域は右上方向に縮小することがわかった。
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