| 研究概要 |
我々はエビタケ由来(Trachyderma tsunodae K-2593)のピリルビンオキシダーゼ(BOD(Tra))と微生物由来(Acremonium sp HI-25)のアスコルビン酸オキシダーゼ(AOD(Acr))が、いずれも活性部位にType 1,Type 2,Type 3銅を持つマルチ銅酵素であることを明らかにした。我々はBOD(Tra)遺伝子の酵母内での発現系の構築とAOD(Acr)の性質について研究を進めている。
1) BOD(Tra)遺伝子の発現系の構築の試み
昨年度は高発現系ベクターpYE22m(GAPプロモーター)を用いてパン酔母(Saccharomyces crevisiae)での発現を試みたがうまく行かなかった。そこでpYE22mにつないだBOD(Tra)遺伝子(W-7)の両端のシークエンスを読み直したところ、アダプター配列中にNcoIサイトがあることが判った。NcoIサイトにはATGの開始コドンがあり、ここから蛋白質の翻訳が始まってしまい、フレームがずれるために、BOD(Tra)が発現しなかったと推定された。そこで、高発現ベクターpYES2を用いてHin IIIサイトにBOD(Tra)遺伝子(W-7)を組み込み、出芽酵母(Saccharomyces crevisiae)中での発現を試みた。遺伝子が酵母で発現し、BOD(Tra)を生産しているかどうかを確認するために、上清と菌体の酵素活性を測定したが活性は示さなかった。また、蛋白を確認するためにSDS-PAGEを行い、ブロッティングしBOD(Tra)と思われるバンドのN-末端アミノ酸配列を見たが、BOD(Tra)ではなかった。
2) AOD(Acr)の性質
アスコルビン酸オキシダーゼの基質として、その酸化還元電位がどのpHでも一定であるフェロシアンイオン(Fe(CN)_6^<4->)を使用し、そのKm及びkcatのpH依存性を検討した。Km及びkcatのpH依存性は、基質をアスコルビン酸にした場合と大きく異なっていた。
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