部位特異的変異導入法による複製開始蛋白DnaAの活性制御機構の解明

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09672236
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 水島 徹 岡山大学, 薬学部, 助教授 (00264060)
• キーワード: DNA複製 / DnaA蛋白 / ATP

研究概要

大腸菌染色体DNAの複製開始蛋白であるDnaAはATP及びADPと高い親和性を持っており、試験管内複製系において、ATP結合型DnaA蛋白は活性を持つのに対し、ADP結合型は不活性である。したがって細胞内において、DnaA蛋白の活性制御がATP/ADP結合により制御されていることが考えられていたが、その具体的な分子メカニズムは明かではなかった。
研究代表者らは、DnaA蛋白が弱い内在性のATPase活性を有していることに着目し、このATPaseが複製開始を負に制御しているという仮説を立てた。そして、部位特異的変異導入により、減弱したATPase活性を持つ変異DnaA蛋白を構築し、この変異蛋白の細胞内での発現が、過剰な複製開始を導き、細胞を優性致死とすることから上記の仮説を証明した。さらに研究代表者らは、このATPaseの促進因子を大腸菌粗抽出液中に発見し、この因子が一本鎖DNAによって活性化されることから、複製開始反応により生ずる一本鎖DNAがATPaseの促進因子を活性化し、DnaA蛋白を不活性なADP結合型に変換し、再複製開始を抑制するという、再複製開始抑制機構に対する全く新しいモデルを提唱した。本研究計画では、このモデルの妥当性を分子レベルで示すために、ATPaseの促進因子を遺伝学的、生化学的に単離することを試みた。既に遺伝学的スクリーニングから、dnaN遺伝子(DNApolymeraseIIIのβサブユニット)、生化学学的スクリーニングからDNApolymeraseIIIのβサブユニットがこのATPase促進活性の一部を担うことを見いだしており、今後、他の候補遺伝子及び蛋白を同定し、DnaA蛋白のATPase促進による再複製開始抑制反応の試験管内再構成を目指す。

研究成果

• [文献書誌] Mizushima,T.: "Increase in negative supercoiling of plasmid DNA in Escherichia coli exposed to cold shock." Mol.Microbiol.23. 381-386 (1997)
• [文献書誌] Kubota,T.: "Conformational transition of DnaA protein by ATP :,structual analysis of DnaA protein,the initiator of Escherichia coli chromosome replication." Biochem.Biophys.Res.Commun.232. 130-135 (1997)
• [文献書誌] Ohba,A.: "Amounts of proteins altered by mutations in the dnaA gene of Escherichia coli." FEBS.Lett.404. 125-128 (1997)
• [文献書誌] Mizushima,T.: "Negative control of DNA replication by hydrolysis of ATP bound to DnaA Protein,the initiator of chromosomal DNA replication in Escherichia coli." EMBO J.16. 3724-3730 (1997)
• [文献書誌] Mizushima,T.: "Inhibition of thymidine transport in dnaA mutants of Escherichia coli." J.Biol.Chem.272. 21195-21200 (1997)
• [文献書誌] Katayama,T.: "Overinitiation of chromosomal replication in the Escherichia coli dnaAcos mutant depends on activation of oriC function by the dam gene product." Mol.Microbiol.25. 661-670 (1997)