| 研究概要 |
1.PLA_2の触媒機構の解明―ウシ膵臓由来PLA_2とその触媒基His48の選択的修飾剤であるBPBとの反応のpH依存性を調べ,以前得られたヘビ毒由来PLA_2の結果と比較したところ,I型PLA_2のみにN末端αアミノ基の関与が見られた.この結果から,I型とII型PLA_2の活性部位に含まれるアミノ酸残基は保存されているにもかかわらず,それらの立体構造上のミクロ環境には違いがあることが示された.また,ウシ膵臓由来PLA_2のプロ体とアミド基を持つ基質アナログとの複合体の立体構造を明らかにし,阻害剤のアミド基がHis48と水素結合を形成することを示した.他方,テルペノイドの一種である3-methoxy-carbony1-2,4,6-trienalがPLA_2の強力な不活性化剤になることを明らかにし,その不活性化はPLA_2分子内のLys 56の化学修飾によることを示した.
2.PLCの触媒機構の解明―B.Cereus菌由来スフィンゴミエリナーゼの酵素反応速度論に基づく実験を行い,本酵素には親和性の異なる2つのMg^<2+>結合部位が存在し,低親和性部位に対するMg^<2+>の結合は触媒作用に必須であるが,基質結合に関与しないことを明らかにした.また,触媒作用はHis296(pK=5.85)による一般塩基触媒によることも推測した.さらに,Asp残基の役割を明らかにするために変異体酵素を作成した.その結果,Asp126のカルボキシル基の解離は,酵素の基質に対する結合力を増大させるが,触媒作用は低下させることがわかった.
|
