細胞内ポリアミンの作用点となる蛋白質の検索

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09672285
• 研究機関: 城西大学
• 研究代表者: 白幡 晶 城西大学, 薬学部, 助教授 (50150107)
• キーワード: ビオチン / スペルミジン / スペルミン / ポリアミン / トランスグルタミナーゼ / 遊離型濃度 / 蛍光標識 / TFO

研究概要

機能性ポリアミンアナログの合成とその作用についての検討:機能性ボリアミンの合成に当たり、モノアシル化が選択的に可能な中間体の合成法を検討し、ビオチン標識スペルミンおよびフルオレッセイン標識スペルミンをモデルとして合成可能であることを示した。合成した蛍光誘導体化ポリアミンは、蛋白質の細胞内分解に関与が予想されるアルギニルトランスフェラーゼの活性測定基質の合成に応用し、本酵素の放射性同位体を用いない活性測定法を確立した。
ポリアミン結合蛋白質の検出:細胞内ポリアミンによる蛋白質標識への組織トランスグルタミナーゼ(TGase)の関与を探るため、ビオチン標識ポリアミンを基質として用いるTGaseのマイクロプレート活性測定法を確立し、モルモット組織TGaseの活性部位構造を検討した。その結果TGaseはポリアミンの末端ジアミン構造のみを認識することが明らかになり、昨年度明らかにしたHTC細胞内におけるビオチン標識ポリアミン構造に特異的な標識は、他の酵素の関与か、細胞内局在の違いに基づくことが示唆された。
ポリアミンの枯渇、蓄積により影響を受ける細胞機能の解析:遊離ポリアミン濃度を測定する方法論の開発をめざして、細胞をオイル中限外ろ過膜上で破砕したのち、細胞質液を限外ろ過する方法を考案し、ろ液中のポリアミン濃度を測定することで、HTC細胞内の遊離ポリアミン濃度に相当する測定値の算出が可能であることを示した。
ポリアミンアナログの合成とその作用についての検討:昨年度までに合成した化合物のいくつかは、ポリアミン輸送系、NMDA受容体におけるポリアミン認識の検討に用いた。また、本研究は蛋白質を標的とするものであるが、ペンタミンおよびヘキサミンのDNAのトリプレックス形成能、および細胞内へのTFO(triplex fomrming oligonucleotide)遺伝子の導入試薬として用いる可能性についても検討し、ヘキサミンがTFOの細胞内への導入とトリプレックスの形成に極めて有用であることを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] R.M.Thomas et al.: "Facilitation of the Cellular Uptake of a Triplex-Forming Oligonucleotide by Novel Polvamine Analogues : Structure-Activity Relationships"Biochemistry. 38. 13328-13337 (1999)
• [文献書誌] T.Antony et al.: "Selectivity of Polyamines on the Stability of RNA-DNA Hybrids Containing Phosphodiester and Phosphorothloate Oligodeoxyribonucleotides"Biochemistry. 38. 10775-10784 (1999)
• [文献書誌] M.Saminathan et al.: "Ionic and Structural Specificity Effects of Natural and Synthetic Polyamines on the Aggregation and Resolubilization of Single-,Double,and Triple-Stranded DNA"Biochemistry. 38. 3821-3830 (1999)
• [文献書誌] Thomas Antony et al.: "Selectivity of Spermine Homolos on Triplex DNA Stabilization"Antisence and Nucleic Acid Drug Development. 9. 221-231 (1999)
• [文献書誌] M.Wada et al.: "Primary Structure of Rat Spermidine Synthase : An Example of Refining the cDNA-Derived Amino Acid Sequence"Biol.Pharm.Bull.. 22. 889-895 (1999)
• [文献書誌] K.Takao et al.: "Preparation and Usefulness of Some Fluorogenic Substrate for Assay of Arginyl-tRNA-Protein Transferase by HPLC"Anal.Biochem.. 267. 373-381 (1999)