| 研究概要 |
我々は現在までに以下の点について明らかにした。
制限酵素を用いた骨粗鬆症の遺伝子多型を高分解能キャピラリー電気泳動で解析するため、骨密度と関連を示すVDRgeneのIntron8及びExon9上のRFLP部位(Bsm 1,Apa 1,Taq 1)を挟むようにPCRを行い、制限酵素BsmI,ApaI,TaqIを作用させ、レーザー励起蛍光検出キャピラリー電気泳動で解析した。PCR条件、制限酵素反応、分離条件について検討し、三種のRFLP多型(Bsm 1,Apa 1,Taq 1)を数分で解析する方法を開発した。
次に通常のゲル電気泳動(PAGE)を用いて一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)による三種の多型の解析の可能性について検討した。即ち、同変異部位を挟むようにPCRにより遺伝子を増幅、次に一本鎖に解裂後、それぞれのSSCPをPAGEを用いて解析した。この実験ではPCR増幅部位、増幅するDNAサイズ、ゲル濃度、分離温度について検討した。その結果、ApaI部位でのSSCPでは、DNA155bp,ゲル濃度8%、分離温度25℃で、AA型、Aa型(ヘテロ)、aa型を明瞭に分離した。TaqI部位ではApaI部位で用いたPCR生成物を用い、4℃で分離を行ったところ、TT型、Tt型、tt型を明瞭に分離することができた。つまりApaI部位とTaqI部位を単に温度変化することにより二種の多型を検出することが可能であった。
一方より簡便でかつ多量の試料を一度に解析するための方法として、生物発光RFLP-ELISA法の確立について検討した。即ち、ビチオン(センス側)及びフルオレセイン(アンチセンス側)標識プライマーを用いたRCR条件の検討、抗フルオレスセイン抗体固相化プレート上にトラップされたPCR生成物のルシフェラーゼ/アセテートキナーゼ発光反応による検出ついて検討した。その結果、生物発光RFLP-ELISA法は電気泳動を用いた方法と同様な正確さでVDR遺伝子多型を解析することができた。
|
