| 研究課題/領域番号 |
09672366
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
安藤 泰彦 東海大学, 医学部, 教授 (50051470)
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| 研究分担者 |
宮地 勇人 東海大学, 医学部, 助教授 (20174196)
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| キーワード | ヒト血小板 / PGI_2レセプター / TXA_2レセプター / m-RNA / RT-PCR / ビオチン化プライマー / 定量化 / ELISA系アッセイ |
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| 研究概要 |
平成9年度は、正常血小板において、血小板PGI_2レセプター及びTXA_2レセプターのm-RNAを定量化するため、ビオチン化プライマーを用いたRT-PCRに続き、高感度、高特異性、かつ簡素化したELISA系によるアッセイ系を確立した。
1)洗浄血小板の作製
正常人ACD血を採取し、従来法によりPRPを作製、washing bufferで洗浄後、そのペレットを洗浄血小板とした。
2)RNAの分離
RNAの抽出はRNA抽出キットSepa Gene RV-R(三光製薬)を用いて行なった。
3)血小板PGI_2レセプターとTXA_2レセプターのRT-PCR増幅
近年、ヒト血小板PGI_2レセプターとTXA_2レセプターがクローニングされ、そのシーケンスが明らかになった。本研究では、それをもとにPCR用プライマーを各々2種(上流と下流)作製し、RT-PCRの条件を決定した。そして、PCR増幅されているかどうかをエチジウムブロマイド染色にて、確認した。
4)RNAの定量系の確立
当研究の為に開発した定量系は、あらかじめ当病院で定性試験として行われている急性リンパ性白血病患者(ALL)のbcr-abl検出法を改良して定量性を持たせ、その陽性検体を用いてbcr-abl発現量を定量し、この系の有用性を明らかにした。この系はPCR増幅サンプルと固相化ALL特異的プローブとのハイブリダイゼーションに続く酵素発色によるマイクロプレートハイブリダイゼーション法である。現在この定量系を応用してPGI_2レセプターとTXA_2レセプターの定量系を確立しているところである。
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