| 研究課題/領域番号 |
09672367
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
|---|
研究代表者 |
町田 勝彦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (70056886)
|
|---|
| 研究分担者 |
河野 緑 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (00225385)
保科 定頼 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (30119846)
桜井 進 河野臨床検医学研究室, 主任研究員 (20056542)
上出 良一 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (40119780)
|
|---|
| キーワード | 黄色ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群 / ブドウ球菌性表皮剥脱素 / フィブロネクチン |
|---|
| 研究概要 |
今年度の研究日標は黄色ブドウ球菌性表皮剥脱素血清型A(ETA)の標的物質の解析に重点をおいた。ETAによってin vitroで切断されたヒト血漿由来フィブロネクチン(FN)、分子量460kDaをゼラチン セファロースカラムによるアフィニティークロマトによって分画し、0.05M酢酸ナトリウムpH5.0で溶出される分画をSDS-7.5%PAGEにかけた後、セミドライ法でクリアブロット-P膜に転写し、coomassie brilliant blue G-250染色によって検出した90kDa、70kDa、50kDa分別帯のうち、70kDa分別帯のN末端アミノ酸配列を決定した。この70kDa断片のN末端アミノ酸配列は、FNのN末端から1439残基目の後流の配列に相当していた。70kDaのN末端アミノ酸配列を基にして24merのオリゴヌクレオチドプライマー(ETA5)を作製した。
新産仔マウスならびに生後10日のマウスからmRNAを分離し、各々のcDNAライブラリーを調整した。これらのcDNAをBamH Iで消化し、LA PCR in vitro Cloning(TAKARA)を用いてSau3A Iカセットを連結し、カセットプライマーC1およびETA5をプライマーとしてPCRを行った結果、分子サイズは280bpのバンドを得た。これをpUC19に連結して大腸菌に導入し、そのtransformantからrecombinant plasmidを調整した。これを鋳型としてsequencing primer(M13 primer M4,RV)を用いてPCRを行い、280bp断片が増幅される複数のrecombinant plasmidが得られた。これらのrecombinant plasmidを精製し、現在、塩基配列の解析を進めている。なお、次年度にはETAの標的物質(基質)を決めて、それに対する抗体を作製する予定である。
|
