S期特異的に発現する核蛋白質の新しい遺伝子の単離と放射線に対する応答に関する研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680540
• 研究機関: 放射線医学総合研究所
• 研究代表者: 武藤 正弘 放射線医学総合研究所, 生物影響研究部, 研究員 (80166230)
• キーワード: DNA複製 / Rb結合モチーフ / Np95 / 細胞周期 / PCNA / 修復 / モノクローナル抗体 / ヒトホモログ

研究概要

S期特異的に発現する新規核蛋白質NP95のcDNAクローンを分離した。この遺伝子産物は、95kDaの分子量を持ち、放射線発がん高発系B10系マウスでは前がん細胞の発生する時期に高発現することや、リンパ腫では細胞周期によらず異常発現する。また抗Np95(Th-10a mAb)をFlTC標識し、抗PCNA(PC10)をTexas Redで標識して、m5S細胞を二重染色して解析したところ、G1期及びS期において核内でNp95とPCNAの局在が、ドット状に一致して分布していることが示された。前年度において、ES細胞にNp95の遺伝子のターゲッテングベクターを取り込むことに成功し、さらにネオマイシンの濃度を上げることによって、もう一方の対立遺伝子のNp95遺伝子も欠損している細胞株ES.Np95-/-を作成することが出来た。これらの細胞について、放射線に対する応答性を調べたところ、Np95遺伝子欠損細胞は、放射線感受性であることが、明らかになった。
平成11年度においては、これらの細胞のUV及びアルキル化剤(MNNG)に対する反応性を調べたところ、Np95遺伝子欠損細胞は、UV及びアルキル化剤(MNNG)に対して、同様に感受性を示した。さらにNp95遺伝子の機能を解析するために、Np95遺伝子のヒト・ホモログの分離を行い、それの核蛋白に対する抗体を得ることを、計画した。現在までに、人の精巣のcDNAライブラリーから、Two-Step PCR法を使用して、いくつかのcDNAクローンを分離することが出来、解析の結果、isoformがいくつか存在している事が明らかになった。今後は、Np95遺伝子欠損細胞と正常細胞との間で、DNA修復、複製あるいは細胞周期に関して、どの様な違いがあるのかを明らかにする。さらに遺伝子発現プロフィールの手法を使用して、Np95遺伝子の機能解析を行う。

研究成果

• [文献書誌] Fujimori A.: "Cloning and mapping of Np95 gene which encodes a novel nuclear protein associated with cell proliferation"Mammalian Genome. 9. 1032-1035 (1998)
• [文献書誌] Muto M.: "The characterization of the monoclonal Antibody Th-10a specific for a nuclear protein appearing in the S Phase of the cell cycle in normal thymocytes and its unregulated expression in Iymphoma cell lines"Cell Prolif.,. 28. 645-657 (1995)
• [文献書誌] Muto M.: "Analysis of Early Initiating Event(s) in Radiation-Induced Thymic Lymphomagenesis"Jpn.J.Cancer Res.. 87. 247-257 (1996)
• [文献書誌] Chen Y.: "Cytogenetic analysis of thymocytes during early stages after irradiation in mice with different susceptibilities to radiation-induced lymphomagenesis"J.Radiat.Res.. 37,. 267-276 (1996)
• [文献書誌] Araki R.: "Nonsense mutation at Tyr-4046 in the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit of severe combined immune deficiency mice"Proc.Natl.Acad.Sci.USA.. 94. 2438-2443, (1997)
• [文献書誌] Kawai H.: "Isolation and characterization of apoptosis-resistant mutants from a radiosensitive mouse lymphoma cell line"Radiat.Res.. 149. 41-51, (1998)
• [文献書誌] Uemura T.: "Temporal and Spatial Localization of Novel Nuclear Protein NP95 in Mitotic and Meiotic Cells"Cell Structure and Function. (in press). (2000)
• [文献書誌] Uchimura E.: "Transient Infiltration of neutrophils into the thymus in association with apoptosis induced by whole body X-irradiation"J.Leukocyte Biology. (in press). (2000)