コンドロイチン4硫酸転移酵素の精製とクローニング

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680587
• 研究機関: 愛知教育大学
• 研究代表者: 羽渕 脩躬 愛知教育大学, 教育学部, 教授 (90024067)
• キーワード: コンドロイチン硫酸 / 硫酸転移酵素 / 軟骨肉腫細胞 / デルマタン硫酸 / プロテオグリカン

研究概要

ラット軟骨肉腫細胞の培養液に分泌される硫酸転移酵素の性質を調べた結果、コンドロイチンのGal NAc残基の4位に硫酸基を転移するコンドロイチン4硫酸転移酵素(C4ST)は分泌されるがGal NAc残基の6位に硫酸基を転移するコンドロイチン6硫酸転移酵素(C6ST)は全く分泌されないことが分かった。そこでラット軟骨肉腫細胞の無血清培養液を原料として、ヘパリンセファロースCL-6B、Matrex gel red A-アガロース、3',5'-ADP-アガロース、2回目ヘバリンセファロースを用いたクロマトグラフィーによりC4STを均一に精製した。精製された酵素は非還元条件のSDS-PAGEでで50と54kDaの幅広いバンドを示し、ジチオスレイトールのようなスルフヒドリル基をもつ化合物により活性化された。精製C4STはコンドロイチン、脱硫酸化デルマタン硫酸に硫酸基を転移したが、イカ軟骨のコンドロイチン硫酸E、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、完全に脱硫酸化後N再硫酸化したヘパリンには転移しなかった。コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸Cには低い効率で硫酸基が転移された。硫酸化されたコンドロイチン、脱硫酸化デルマタン硫酸をコンドロイチナーゼABCで消化すると、ΔDi-48のみが得られることから、Gal NAc残基の4位のみが硫酸化されることが分かった。脱硫酸化デルマタン硫酸を基質としたときは、GlcA残基に富んだ部分が優先的に硫酸化された。このことからこの酵素はGlcAとIdoAを識別することが考えられる。精製酵素をエンドペプチダーゼで消化し、ペプチドを逆相キャピラリーHPLCで分離し、得られたペプチドのアミノ末端のアミノ酸配列を調べた結果、6種類の配列を得ることが出来た。現在このアミノ酸配列に基づいてcDNAのクローニングを行っている。

研究成果

• [文献書誌] Fukuta M,Inazawa J,Torii T,Tsuzuki K,Shimada E,Habuchi O: "Molecular cloning and characterization of keratan sulfate Gal-6-sulfotransferase" J.Biol.Chem.272. 32321-32328 (1997)
• [文献書誌] Habuchi O,Suzuki Y,Fukuta M.: "Sulfation of sialyl lactosamine oligosaccharides by chondroitin 6-sulfotransferase" Glycobiology. 7. 405-412 (1997)
• [文献書誌] Fukuta M,Kobayasi Y,Uchimura K,Kimata K,Habuchi O: "Molecular cloning and expression of human chondroitin 6-sulfortansferase" Biochim.Biophys.Acta. 1399. 57-61 (1998)
• [文献書誌] Uchimura K,Muramatsu H,Kadomatsu K,Fan QW,Kurosawa N.,Mitsuoka C,Kannagi R,Habuchi O,Muramatsu T.: "Molecular cloning and characterization of an N-acetylglucosamine 6-O-sulfotransferase" J.Biol.Chem..273. 22577-22583 (1998)
• [文献書誌] Hasegawa N,Torii T,Nakayasu I.,Miyajima H,Habuchi O: "Measurement of activities of human serum sulfotransferases which transfer sulfate to galactose residue of keratan sulfate and to nonreducing end N-acetylglucosamine trisacchride" J.Biochem.125. 245-252 (1999)
• [文献書誌] Yamauchi S,Hirahara Y,Usui H,Takeda Y.,Hoshino M,Fukuta M,Kimura JH,Habuchi O.: "Purification and characterization of chondroitin 4-sulfotransferase from the culture medium of a rat chondrosarcoma cell line" J.Biol.Chem.274. 2456-2463 (1999)