低分子量酵素キチナーゼRS-9Kの活性発現機構

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680589
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 京都工芸繊維大学
• 研究代表者: 原 三郎 京都工芸繊維大学, 工芸学部, 教授 (00028193)
• キーワード: キチナーゼ / イネゲノム / クローニング

研究概要

米ヌカより単離・精製したキチナーゼRS-9Kのアミノ酸配列に基づき、Bam HI切断部位を末端に持つN末端側およびC末端側のプライマーを合成した。イネ子葉からゲノムDNAを抽出し、合成したプライマーを用いてPCR法によりキチナーゼのcDNAを増幅した。得られた9K DNAを配列分析用のベクターにサブクローニングし、DNA Sequencerにて塩基配列を分析して、キチナーゼRS-9Kのアミノ酸配列と相同な塩基配列を持つベクターを選別した。このベクターを導入して形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドDNAを抽出後、Bam HI-9K DNAを切り出し、pET発現ベクターへ挿入しpET発現ベクターにより大腸菌を形質転換し、細胞破砕液をSDS-PAGEで発現タンパク質を検索したが、活性型タンパク質を確認することはできなかった。次ぎに、ヨトウガ細胞に感染するウイルスDNAをベクターとするバキュロウイルス発現系にBam HI-9K DNAを挿入して、組み換えウイルスを作成した。しかし、この系によるタンパク質の発現量も微量であった。十分量のタンパク質の発現を確保するため、マルトースバインディングプロテイン(MBP)とのフュージョンタンパク質として大腸菌で発現する系を採用した。発現したタンパク質はマルトースカラムにより、1ステップで単離・精製された。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびドットブロット法により、フュージョンタンパク質であることが確認された。

研究成果

• [文献書誌] Manabu Shiga et al.: "Pectinolic enzymes from Pseudomonas marginalis MAFF03-01173" Phytochemistry. 45巻7号. 1359-1363 (1997)
• [文献書誌] Ryo Takano et al.: "Concurrence of agaroid and carrageenan chains in funoran from red seaweed Gloipeltis furcata Post et Ruprecht (Cryptonemiaales,Rhodophyta)." Carbohydrate Polymers. (印刷中).
• [文献書誌] Isao Maruta et al.: "Enzymic digestibility of reduced-pressurized,heat-moisture treated starch." Food Chemistry. (印刷中).
• [文献書誌] Koji Ikura et al.: "An established hybridoma clone producing a monoclonal antibody against Vibrio anguilarum." Biosci.Biotech.Biochem.61巻11号. 1939-1941 (1997)
• [文献書誌] Ryo Takano et al.: "Specific 6-O-desulfation of heparin." Carbohydorate Letters. (印刷中).
• [文献書誌] Ryo Takano et al.: "Variety in backbone modification of red algal galactan sulphates." Recent research developments in phytochemistry. 1巻. 195-201 (1997)