ATトラクトを認識する核マトリックス蛋白質のDNA結合機構

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680592
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 筒井 研 岡山大学, 医学部, 助教授 (70108158)
• キーワード: DNA結合タンパク質 / 核マトリックス / 核骨格 / MAR / SAR

研究概要

1.SP120に特異的に結合することが示された合成コンカテマ-DNA(random concatemer,RC)をセファロースに固定化し,これを吸着体として核の抽出液からSP120をアフィニティー精製しすることが可能になった.
2.合成したRC(鎖長は不均一)をゲル電気泳動にかけて鎖長の違いにより分画・精製した.それぞれを^<32>Pで末端ラベルし,過剰の大腸菌DNAの存在下にSP120とのフィルター結合反応を行って結合親和性を比較したところ,ユニット・オリゴマー(26-mer)のhexamer(156bp)がSP120との結合に必要な最短のオリゴ・コンカテマ-であることがわかった.
3.計画調書に詳述した手順により特定の配列をもったオリゴ・コンカテマ-を合成する方法を確立した.具体的には,重合方向に制限を加えるためにユニット・オリゴマーの5′端の4塩基の配列(ライゲーションのタッグとなる)を変化させた11種類のオリゴマーとそれらの相補配列を合成した.これらを適当に組み合わせてアニーリング・ライゲーションし,制限酵素で切り出すことにより,すべての可能なhexamer配列(36種類)を合成した.これらを用いた結合実験はまだ完了していない.
4.ATトラクトに変異を導入した数種類のユニット・オリゴマーを合成し,ランダムライゲーションによりコンカテマ-を調製した.これらを末端ラベルして精製SP120との結合親和性をフィルター結合法で検討した.ATトラクトをG/Cの挿入で破壊したもの,ATトラクトをheteropolymeric(例えば,TATやTAAT)にしたもの,TトラクトをAトラクトに転換させたものやATトラクトの間隔を変えたものでは著しく親和性が低下することが明らかになった.この結果はATトラクトの存在と極性,及び出現間隔がSP120との結合にとって重要な因子であるというバ-コードモデルを支持するものである.

研究成果

• [文献書誌] Tsutsui,K.: "Synthetic concatemers as artificial MAR : importance of a particular configuration of short AT-tracts for protein recognition" Gene Therapy and Molecular Biology. 1 (in press). (1997)
• [文献書誌] Tsutsui,K.: "cDNA cloning of a novel amphiphysin isoform and tissue-specific expression of its multiple splice variants" Biochem.Biophys.Res.Commun.236. 178-183 (1997)
• [文献書誌] Kuriyama,M.: "Induction of resistance to etoposide and adriamycin in a human glioma cell line treated with antisense oligodeoxynucleotide complementary to the messenger ribonucleic acid of topoisomerase IIα" Neurologia medico-chirugica. 37. 655-662 (1997)
• [文献書誌] Nakagawa,Y.: "cDNA cloning,sequence analysis and expression of a mouse 44-kDa nuclear protein copurified with DNA repair factors for acid-depurinated DNA" Acta Med.Okayama. 51. 195-206 (1997)