P450・電子供与体複合体の結晶化と電子伝達機構の構造的解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680651
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 掘 洋 大阪大学, 大学院・基礎工学研究科, 助手 (20127294)
• キーワード: シトクロムP450cam / 基質 / 電子供与体 / 電子伝達機構 / 単結晶顕微分光 / X線結晶構造解析

研究概要

タンパク分子は構造変化してその機能を調節する。P450camも例外ではないと考えられる。溶液における種々の物理化学的測定から溶液での分子構造は幾つかの構造状態の平衡である事が示唆されており、X線解析の結果はある一つの状態だけを見ているのではないだろうか?酸化状態の認識、基質の認識、電子供与体結合認識がどの様な「構造変化」を伴ってなされるのか、色々な結晶化条件で作製した単結晶による詳細なX線結晶構造解析を行ない、溶液状態における分子の構造変化、電子状態の変化と機能調節機構との相関を解明する事が本研究課題の目的でる。
本年度はPoulosらの結晶化条件とは異なる結晶化条件で、全く基質の結合していないP450camの結晶化(酸化型)を試み、Poulosらの結晶とは異なる結晶を得た。これらの単結晶を、結晶状態のままで基質が結合するか否か、単結晶顕微分光法で光吸収スペクトル変化を調べた結果、この結晶には基質は結合しない事が判った。このことは基質結合部位やその周辺の構造に、Poulosらの基質非結合型結晶の構造と違いがあると推定された。
この結晶を用いて、X線結晶構造解析を行なった。Poulosらの基質非結合型の構造と比較すると主鎖のズレが分子全体でみられ、ヘム面も傾いている。基質と直接に水素結合する96番目のチロシン残基の水酸基の向きが、camphorの結合を安定化する向きとはかなり異なる方向を向いており、camphorが安定に結合しない構造をとっている事が構造解析から示された。この結果は単結晶顕微分光の結果と矛盾しない。今回の解析結果は、溶液中で平衡にある幾つかの構造状態のひとつの分子構造に対応していると考えられ、構造の精密化を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Hirohito Yoneyama: "Optical and electron paramagnetic resonance absorption spectra of complexes of nitric oxide synthase I with isocyanides" Biochim. Biophys. Acta. 1335. 253-264 (1997)
• [文献書誌] Motonari Tsubaki: "Existence of Two Heme B Centers in Cytochrome b_<561> from bovine adrenal chromaffin vesicles as Revealed by a New Purification Procedure and EPR Spectroscopy" J. Biol. Chem.272. 23206-23210 (1997)
• [文献書誌] Sam-Yong Park: "Crystallization,preliminary diffraction and electron paramagnetic resonance studies of a single crystal of cytochrome P450ner" FEBS Lett.412. 346-350 (1997)
• [文献書誌] Motonari Tsubaki: "Resonance Raman,infrared and EPR investigation on the binuclear site structure of the heme-copper ubiquinol oxidases from Acetobacter aceti" Biochemistry. 36. 13034-13042 (1997)
• [文献書誌] Motonari Tsubaki: "20β-Hydroxy-C_<21>-Steroid 20β-Oxidase Activity of Cytochrome P450c_<21> Purified from Borine Adrenocortical Microsomes" Biochim. Biophys. Acta. (印刷中). (1998)
• [文献書誌] Hideo Shimada: "Oxygen Binding to P450cam Induces Conformational Changes of Putidaredoxin in the Ferrous P450cam-Reduced Putidaredoxin Complex" Oxygen Homeostasis and Its Dynamics : keio University Symposia for Life Science and Medicine ed.Y.Ishimura. Vol.1. 139-146 (1998)