P450・電子供与体複合体の結晶化と電子伝達機構の構造的解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680651
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 堀 洋 大阪大学, 大学院・基礎工学研究科, 助手 (20127294)
• キーワード: シトクロムP450cam / 基質 / 電子供与体 / 電子伝達機構 / X線結晶構造解析 / プチダレドキシン / EPR / 電子・核二重共鳴(ENDOR)

研究概要

1)EPRでみる鉄イオウタンパク質・P450複合体の協同的構造変化:
一原子酸素添加酵素反応でP450camは直接の電子供与体であるプチダレドキシン(Pdxと略記)と1:1の複合体を形成する。この還元型複合体でP450camの還元型ヘム鉄に一酸化炭素が結合すると還元型PdxのEPRスペクトルが有意に変化することを見い出し、報告した。コレステロールを基質とし、その側鎖の開裂反応を触媒するP450sccと電子供与体であるアドレノキシン(Adx)の1:1複合体で調べた結果、20S-ヒドロキシコレステロール存在下の複合体に於いて、還元型AdxのEPRスペクトルにP450cam-Pdxと同様の変化が認められた。
2)プチダレドキシン・P450cam複合体の電子・核二重共鳴(ENDOR):
単離した還元型Pdxのプロトン核由来のENDORスペクトルは既に報告されているが、還元型P450camと複合体を形成するとENDORスペクトルが顕著に変化すること、還元型P450camにCOが結合すると自由プロトン核近傍の狭い分裂幅を持つENDORシグナルの強度が更に増大することを初めて見い出した。Pdxの構造変化が複核中心の不対電子とシステイン残基のプロトン核とどの様な相互作用に拠るのか現在、解析中である。
3)プチダレドキシン・P450cam複合体の結晶化:
プチダレドキシン・P450cam複合体のX線結晶構造解析は結合部位の決定、電子伝達の道筋を解明するためには不可欠である。両酵素の大量精製を行い、様々な結晶化条件でプチダレドキシン・P450cam複合体の結晶化を精力的に行った。複合体の結晶化は現在も成功していない。今後に残された重要課題である。

研究成果

• [文献書誌] Hideo Shimada: "Putidaredoxin-Cytochrome P450cam Interaction: Spin State of the Heme Iron Modulates Putidaredoxin Structure"J.Biol.Chem.. 274. 9363-9369 (1999)
• [文献書誌] Ryu Makino: "EPR Characterization of Axial Bond in Metal Center of Native and Cobalt-substituted Guanylate Cyclase"J.Biol.Chem.. 274. 7714-7723 (1999)
• [文献書誌] Shiro Kominami: "Electron Paramagnetic Resonance Studies on the Distal Region of the Ferric Heme in Rat Neuronal Nitric Oxide Synthase"J.Biochem.. 126. 756-761 (1999)
• [文献書誌] Motonari Tsubaki: "Furier-transform infrared studies on azide-binding to the binuclear center of the Escherichia coli bo-type ubiquinol oxidase"FEBS Lett.. 449. 191-195 (1999)
• [文献書誌] Motonari Tsubaki: "Azide-and Cyanide-binding to the Escherichia coli bd-type Ubiquinol oxidase Studied by Visible Absorption, EPR and FTIR Spectroscopies"J.Biochem.. 126. 510-519 (1999)
• [文献書誌] Motonari Tsubaki: "Fluoride-Binding to the Escherichia coli bd-Type Ubiquinol Oxidase Studied by Visible Absorption and EPR Spectroscopies"J.Biochem.. 126. 98-103 (1999)