| 研究課題/領域番号 |
09680728
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
荒木 正健 熊本大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (80271609)
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| 研究分担者 |
吉信 公美子 熊本大学, 遺伝子実験施設, 助手 (20274730)
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| キーワード | in situ hybridization / RT-PCR / マウス胎児 / Hox遺伝子 / ES細胞 / 遺伝子トラップ |
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| 研究概要 |
(1) 前年度樹立したトラップクローン(ES細胞)の解析を行った。ES細胞とへテロマウスの両方について、レポーター遺伝子であるβ-geo遺伝子の発現を、X-gal染色により調べた。ES細胞において強い発現が検出されたトラップクローンの中のひとつ、Ayu-8008は、マウス8.5日胚では卵黄嚢・体節・神経板に、9.5日胚ではさらに心臓・尾芽に発現を示した。15.5日胚になると脳、心臓、筋肉においても発現を示した。成体では、脳・心臓・肺・腎臓・精巣・膀胱・皮膚などに発現を示した。
(2) ES細胞を材料としてin situ RT-PCR法の条件検討を行った。プローブにはp-geo遺伝子をポジティブコントロールとして用いた。プロテアーゼ処理、PCR(遺伝子増幅)、ハイブリダイゼーションなど各ステップについて最適条件を検討した。次に材料としてヘテロマウスの組織切片を用い、in situ RT-PCR法の条件検討を行った。X-gal染色の結果と矛盾しない程度の結果は得られたのだが、バックグランドが比較的強く、X-gal染色より高感度な系とは言えない状況である。
(3) 次年度は、サンプル処理の方法をさらに改善してバックグランドを下げることにより、X-gal染色以上の高感度なアッセイ系の確立を目指す。次に、トラップクローンから単離した遺伝子をプローブにし、in situ RT-PCR法を用いて、発現時期及び部位を解析する。
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