| 研究課題/領域番号 |
09680728
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
荒木 正健 熊本大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (80271609)
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| 研究分担者 |
吉信 公美子 熊本大学, 遺伝子実験施設, 助手 (20274730)
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| キーワード | in situ hybridization / RT-PCR / マウス胎児 / Hox遺伝子 / ES細胞 / 遺伝子トラップ |
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| 研究概要 |
(1)前年度に引き続き、トラップクローン;Ayu-8008の解析を行った。トラップベクター挿入部位近傍の染色体断片を回収し、その塩基配列を決定したところ、ラットEST(Al548797)と高いホモロジーを示すことが分かった。次に、このEST内部のセンスプライマーとトラップベクター内部のアンチセンスプライマーを用いてRT-PCRを行い、Ayu-8008ヘテロマウスにおいて、融合mRNAが発現していることを確認した。
(2)マウス腎臓切片を材料にしてin situ RT-PCR法の条件検討を行った。プライマーには、マウスargininosuccinate synthetase(ASS)遺伝子をポジティブコントロールとして用いた。プロテアーゼ処理、PCR、DIGシステムによる検出など、各ステップについて最適条件を検討した。プローブによるハイブリダイゼーションステップを省き、PCR時にDIG-dUTPを直接取り込ませることにより、バックグラウンドを下げることが出来た。次に材料としてAyu-8008ヘテロマウス及び正常マウスの組織切片に関して、(1)で使用したプライマーを用いて、in situRT-PCRを行った。その結果、X-gal染色と矛盾しない結果が得られた。ただし、検出感度に関しては、やはり、PCRのサイクル数を多くするとその分バックグラウンドが高くなるため、期待していたような高感度アッセイ系の確立には至らなかった。
(3)Ayu-8008ホモマウスの表現型に関しては、一部成長遅滞が見られるものの、遺伝的背景の影響が予想されたため、C57BL/6への戻し交配を進めているところである。
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