単一細胞レベルでの抑制性グルタミン酸レセプター遺伝子の抽出

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680762
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 渡邊 和子 岐阜大学, 医学部, 講師 (40158621)
• 研究分担者: 小野塚 実 岐阜大学, 医学部, 講師 (90084780)
• キーワード: グルタミン酸レセプター / 抑制性応答 / 単一細胞 / RT-PCR / レセプターのクローニング

研究概要

興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸はシナプス電位を可塑的に増強し、記憶の形成に重要な役割を果たしているが、近年、グルタミン酸の抑制性応答が脊椎動物及び脊椎動物の神経系で見いだされるようになった。この抑制性グルタミン酸レセプターの存在は複雑なネットワークを形成している中枢神経系においてその機能的意義が注目されている。しかしこの抑制性レセプターのクローニングはまだ行われていない。本研究では、単一ニューロンレベルでの分子遺伝学的な解析技術を駆使した、Euhadraの単一細胞から、我々がその存在と細胞分子内機構を明らかにしている抑制性グルタミン酸レセプターをコードしている遺伝子を抽出することを目的とする。本年度は、既知の興奮性グルタミン酸レセプターサブタイプのクローン化されているサブユニットをプライマーとして使い、我々がEuhadraの単一細胞に同定した抑制性細胞内にこれらサブユニットをencodingするmRNAが存在するか否かを検討した。実験は、Patch-clamp法で目的とする抑制性グルタミン酸応答を示す細胞を電気生理学的に確認した後、あらかじめ逆転酵素、GluR1〜4、NR2A〜D、mGluR1〜6プライマー等必要なreagendsを含んだパッチ電極内に、陰圧をかけ細胞内溶液を吸い取り、first strand cDNA合成を行い、これをさらにsecond PCRにかけ増幅した。プライマーの作成はAudinat E et al(Neuro-chem.Int28:119-136)の方法に従った。これをagarose gel elctrophoresis、Southern blot analysisにかけ、既知のレセプターサブユニットとの相同性を調べた。分析では未知なバンドが比較的多く見られ、既知のレセプターサブユニットとの相同性は認めにくいものであった。しかし、ゲノムDNAのコンタミンの可能性が大きく、現在この除去の有効法を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] K.Watanabe and M.Onozuka: "Glutamate elicits an outward K^+ current which is normally suppressed by a Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II" Brain Research. 650. 336-340 (1994)
• [文献書誌] M.Onozuku, K.Watanabe, S.Nagasaki et al: "Involvement of dotarizine in nigrostriatal dopamine system of adult and aged rats:biochemical and immunohistochemical analysis" Biogenic Amines. 12. 69-82 (1996)
• [文献書誌] M.Onozuka, K.Watanabe, S.Nagasaki et al: "Evidence that a new diphenylpiperazine derivative,dotarizine,has no effect on nigrostriatal dopamine content in rats" Medical Science Research. 24. 113-115 (1996)
• [文献書誌] M.Onozuka and K.Watanabe: "Suppression by calmodulin of glutamate-induced potassium current in identified snail neuorns" Neuroscience Letters. 204. 105-108 (1996)
• [文献書誌] M.Onozuka and K.Watanabe: "Intracellularly applied anti-P70 antibody blocks the induction of abnormal membrane properties by pentylenetetrazole in identified Euhadra neurons" Brain Research. 716. 187-191 (1996)
• [文献書誌] K.Watanabe, T.Yamamoto, S.Ozono, et al: "A novel glutamate-mediated inhibitory mechanism linked with Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinse II in identified Euhadra neurons" Journal of Neurobiology. 32. 139-149 (1997)