単一細胞レベルでの抑制性グルタミン酸レセプター遺伝子の抽出

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09680762
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 渡邊 和子 岐阜大学, 医学部, 講師 (40158621)
• 研究分担者: 西山 勝弘 神奈川歯科大学, 歯学部, 講師 (20084783) ; 小野塚 実 岐阜大学, 医学部, 講師 (90084780)
• キーワード: グルタミン酸レセプター / 抑制性応答 / 単一細胞 / RT-PCR / クローニング

研究概要

昨年度のコンタミン問題を改善し、再度、Euhadraのグルタミン酸抑制性応答細胞から抽出したmRNAからcDNAを合成し、これに既存のグルタミン酸レセプター(GluR)subunitの各プライマーを加えてPCRを行い、得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。lonotropic typeのGluR(iGluR)のcDNASubnitとの比較では、GluR1〜4fragmentsに相当する749bPのバンドは出現せず、全く相同性は認められなかった。目的とするEuhadraグルタミン酸抑制性応答受容体(E-Glu-Inhibit-R)はiGluRのantagonistsに感受性がなく、Na^+-、およびCa^<2+>-チャンネルブロッカーに非感受性で、PTXおよびCTXにinsensitiveなGq蛋白との共役があること(Watanabe et al,j.Neurobiol.,32:139-149,1997)などの薬理学的・電気生理学的特性が、これらiGluRsの特性と全く異なることから、これらの結果は予測された結果であった。一方、G蛋白と共役するmetabotropic typeのGluRs(mGluRs)のcDNAサブユニットとは膜貫通セグメント部位における相同性が推測され、薬理学的特性から考えるとキスカール酸を強力なアゴニストとするサブタイプグループ(mGluR1 and5)との部分的相同性も予測された。mGluR1〜6に共通していることがわかっている膜貫通セグメントIIIおよびIVを基に作製したプライマーを使ったPCB増幅断片の比較では、近似のバンドが認められた。これをサブクローニングし、シークエンシングしたところ、未知と思われるものが少なくとも2つ見つかった。現在このPCR産物をプローブにライブラリーのスクリーニングを行なっており、クローンの全長が得られたら、アフリカツメガエルの卵に受容体が発現するか否かを検討する。また、目的レセプターが既存のものと異なりK+チャンネルと連結していることから、これを基にした適当なプライマーの合成を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] M.Onozuka and K.Watanabe: "Suppression by calmodulin of glutamate-induced potassium current in identified snail neuorns" Neuroscience Letters. 204. 105-108 (1996)
• [文献書誌] M.Onozuka, K.Watanabe, S.Nagasaki et al: "Involvement of dotarizine in nigrostriatal dopamine system of adult and aged rats ; biochemical and immunohistochemical analysis" Biogenic Amines. 12. 69-82 (1996)
• [文献書誌] M.Onozuka and K.Watanabe: "Intracellularly applied anti-P70 antibodyblocks the induction of abnormal membrane properties by pentylenetetrazole in identified Euhadra neurons" Brain Research. 716. 187-191 (1996)
• [文献書誌] Watanabe,K., Yamamoto,T., Ozono,S.et al.,: "A novel glutamate-mediated inhibitory mechanism linked with Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinse II in identified Euhadra neurons" Journal of Neurobiology. 32. 139-149 (1997)
• [文献書誌] Karasawa,N., Nagatsu,I., Sakai,T., Watanabe,K.et al: "Immunocytochemical study of catecholaminergic neurons in the senescence-accelerated mouse (SAM-P8) brain" J.Neural Transm.104. 1267-1275 (1997)
• [文献書誌] Onozuka,M., Watanabe,K., Takada,H.et al,: "Glial reacton linked with P70-induced seizure activity in the cerebral corotex of rats." Neurosci Res Commun. 23. 111-117 (1998)