ペプチド結合の加水分解触媒抗体の作成およびアミノ酸配列決定法への応用

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09740473
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 平賀 良知 広島大学, 理学部, 助手 (10238347)
• キーワード: プロテアーゼ / カルボキシペプチダーゼY / 活性部位 / 基質選択性 / ペプチド結合加水分解 / アミノ酸 / 疎水性 / 遷移状態

研究概要

ペブチド結合加水分解反応を触媒するカルボキシペプチダーゼY(CPY)は,他のプロテアーゼによって加水分解されにくいプロリン(Pro)を含めたすべてのアミノ酸に隣接したアミド結合(Xaa-Pro;Xaa=amino acid)をC末端側から加水分解するセリンプロテアーゼである。ペプチド結合の加水分解の触媒抗体の作成を目的として,アミド結合の窒素原子上に水素原子をもたないProおよびサルコシン(Sar)を用い,水素原子の影響について検討した。基質は,ジペプチド(Z-Phe-Yaa;Yaa=Pro,Sar,Gly)を用い,それぞれの基質に対する加水分解速度パラメータを比較した。Yaa加水分解におけるKcat値は,Gly>Pro>Sar,kcat/Km値は,pro>Gly>Sarの順であった。これらのことから,ペプチド結合の窒素原子の水素原子をアルキル置換することによって四面体中間体がより安定化されることが示された。これは,アルキル基の誘起効果によってC-N結合の電子密度が上がり,結合開裂が起こりにくくなっていると考えられる。一方,CPYによるペプチド鎖加水分解におけるP2位アミノ酸の影響を検討した。トリペプチド基質(Z-Xaa-Gly-Pro;Xaa=Phe,Val,Ala,Leu,lle,Gly;Z=benzyloxycarbonyl)を用い,Xaaの違いによるPro加水分解における初速度を比較した。初速度は,Phe>lle>Val>Leu>Ala>Glyの順で,Pheにおける初速度は,Glyの約60倍であった。初速度とXaaの側鎖の疎水性との相関は,Leuとlleを除いて,直線関係が見られた。Leuとlleに相関が見られなかったのは,それぞれの側釘の立体障害と考えられた。これらのことから,CPYは活性部位においてGly-Pro結合だけでなく,P2位アミノ酸の側鎖の疎水性を認識していることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Yoshikazu Hiraga: "(-)-Loliolide and Other Germination inhibitory Active Constituents in Equisetum arvense" Nat.Prod.Lett.10(3). 181-186 (1997)
• [文献書誌] Munetaka Tokumasu: "Selective Conversion of Bromo-oxirane into Tetrahydropyranylacrylate by Epoxide Ring Opening" J.Chem.Soc., Chem.Commun.1997(9). 875-876 (1997)
• [文献書誌] Yoshikazu Hiraga: "Evidence for Biosynthetic meta-Hydroxliation of Benzoic Acid by Means of Isolation of Only meta-Functionalized Phenylpentanoic Acids from Athyrium yokoscense" Nat.Prod.Lett.11(3). 187-192 (1998)
• [文献書誌] Masashi Kurokawa: "3-Hydroxy-5,6-epoxy-β-ionone as Germination Inhibitory Active Constituentin Athyrium yokoscense" Nat.Prod.Lett.12(1). 35-40 (1998)
• [文献書誌] Ryukichi Takage: "Asymmetric Induction in Darzens Condensation by Means of (-) -8-Phenylmenthyl and (-) -Menthyl Auxiliaries" J.Chem.Soc., Perkin Trans.1. 1998(4). 689-698 (1998)
• [文献書誌] Ryukichi Takagi: "Stereoselectives Syntheses of (+) -Rhopaloic Acid A and (-) -ent-and (±) -rac-Rhopaloic Acid A" J.Chem.Soc., Perkin Trans.1. 1998(5). 925-934 (1998)
• [文献書誌] Munetaka Tokumasu: "Selective Ring-expansion of Oxirane into Tetrahydropyan and Tetrahydrofuran by Reagent-controlled Conditions" J.Chem.Research (M). 1998(9). 2217-2236 (1998)
• [文献書誌] Munetaka Tokumasu: "Selective Ring-expansion of Oxirane into Tetrahydropyran and Tetrahydrofuran by Reagent-controlled Conditions" J.Chem.Research (S). 1998(9). 500-501 (1998)
• [文献書誌] Takayuki Suga: "Allelopatic Substances in Ferns" Recent Res.Devel.in Phytochem.2. 429-454 (1998)
• [文献書誌] Munetaka Tokumasu: "Synthesis of rac-Hippospongic Acid A and Revision of the Structure" J.Chem.Soc., Perkin Trans.1. 1999(4). 489-496 (1999)
• [文献書誌] Yoshikazu Hiraga: "Ion-transport Activity of Phenylpentanoic Acids Occurring in the Roots of Athyrium yokoscense" Biosci.Biotechnol.Biochem.in press. (1999)
• [文献書誌] Takayuki Suga: "Dynamic Aspects of Natural Products Chemistry, Chapter 4, Kodansha, Tokyo" Biosynthesis of Monoterpenoids in Higher Plants : Mechanisms of Chain Elongation and Chiral Center Generation, 73-96 (1997)