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本研究では、既知のPseudomonas putida由来のナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子に、我々が先にクローニンダしたAcinetobacter sp.YAA株由来のアニリンジオキシゲナーゼ遺伝子の一部を組み込み、この組換えDNA分子を各種細菌に導入し、発癌性を有するナフチルアミンの分解薗を新規に育種することを目的としている。このうち、平成9年度は、組換えDNA分子の構築と大腸菌での遺伝子の発現を検討する予定であった。
まず、ナフタレン分解菌P.putida PpG1064(NAH)から抽出したナフタレン分解プラスミドNAHを鋳型として、ナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子nahAaAbAcAdをPCR法により増幅した。得られたDNA断片を定法に従い、E.Coli JM109-pUC19の宿主ベクター系でクローニンダしたところ、シャーレ上で藍色色素を蓄積する多数のクローンが得られた。これは、培地中のトリプトファンから宿主大腸菌によって生成されたインドールが、更にナフタレンジオキシゲナーゼによってインドキシルに変換され、自然酸化でインジゴが生成したものである。従って、クローニングは成功し、大腸菌内でナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子が発現したと考えられる。次に、アニリンジオキシゲナーゼのうち、アミノ基の認識と脱離に関与すると推定されるA1及びA2蛋白をコードしたatdA1A2遺伝子部分を、アニリンジオキシゲナーゼ遺伝子atdA1A2A3A4A5を鋳型として、PCR法にて増幅した。増幅されたDNA断片を先にクローニングしたナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子のnahAcとnahAd間にある制限酵素SalI部位に挿入し、E.Coli JM109へクローニングした(実験の都合上、挿入位畳を変更した)。得られたクローンから組換えプラスミドを抽出し、制限酵素分析を行ったところ、設計した組換えDNA分子が得られたことがわかった。
現在、このクローンのナフチルアミン分解能の分析を行っており、平成10年度は更にPseudomonas属細菌及びAcinetobacter属細菌への導入を検討する予定である。
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