オピン脱水素酵素による光学活性二級アミンジカルボン酸誘導体の高立体選択的合成

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09760097
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
• キーワード: Opine compounds / Opine dehydrogenase / Amino acid dehydrogenase / Arthrobacter / Recombinant E.coli / Synthesis / NAD+ regeneration / Enzyme purification

研究概要

本年度の研究の概要として、1)本酵素の遺伝子組換え菌における生産条件の確立。2)本酵素の大量調整。3)補酵素NAD+の再生系の構築、および本再生系の共存下でのオピン化合物の合成条件の確立を行った。
その詳細について具体的に述べる。
1)酵素反応による実際の合成には大量の酵素が必要となる。本酵素の生産には、野生株Arthrobacter sp.1C株ではN-(L-1-Carboxyethyl)-D-phenylalanineといった合成オピン化合物を誘導基質として必要とするが、遺伝子組換えの手法を用いることにより、合成が困難な誘導基質を必要としない本酵素の生産が可能となった。培地条件や培養温度、通気量やその他詳細な検討を行い、組換え菌を用いた本酵素の生産条件を確立した。この際、培地用の各種試薬等の消耗品を購入するために、本補助金が大いに役立った。
2)1)で得られた最適培養条件のもとで組換え体を大量培養し、各種のクロマトグラフィー操作を用いて本酵素を電気泳動的に単一に精製した。この際、各種のクロマトグラフィー担体や試薬等の消耗品を購入するために、本補助金が大いに役立った。
3)本還元縮合反応の際、基質と等モル分、補酵素であるNAD+が必要となる。NAD+は非常に高価であるため、本補酵素の再生系を構築することが必要となってくる。各種の酵素を用いる再生系について詳細に検討し、酵素の入手方法や再生効率等の観点から、最適の系として、蟻酸脱水素酵素酵素用いた再生系を選抜した。次に本再生系の共存下でのオピン化合物の合成条件について検討を加え、最適の反応条件を確立した。この際、各種の再生用酵素および試薬等の消耗品を購入するために、本補助金が大いに役立った。

研究成果

• [文献書誌] Y.Kato, et al.: "Stereoselective Synthesis of Opine-Type Secondary Amine Carboxylic Acids by a New Enzyme Opine Dehydrogenase. -Use of Recombinant Enzymes-" Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic. 1. 151-160 (1996)
• [文献書誌] Y.Kato, et al.: "Irreversible Inactivation of Aspartate Aminotransferase by 2-Oxoglutaconic Acid and Its Dimethyl Ester." Journal of Biochemistry. 120. 531-539 (1996)
• [文献書誌] Y.Kato, et al.: "Inactivation of Brain and kidney Aspartate Aminotransferases by S- (1,2-Dichlorovinyl) -L- cysteine and by S-(1,1,2,2-tetrafluoroethyl)-L-cysteine." Developmental Neuroscience. 18. 505-514 (1996)
• [文献書誌] Y.Asano, et al.: "An Alkaline D-Stereospecific Endopeptidase with β-Lactamase Activity from Bacillus cereus." Journal of Biological Chemistry. 271. 30256-30262 (1996)
• [文献書誌] Y.Kato, et al.: "3-Methylaspartate ammonia-lyase as a marker enzyme of the mesaconate pathway for (S) -glutamate fermentation in Enterobacteriaceae." Archives of Microbiology. 168. 457-463 (1997)
• [文献書誌] Y.Asano, et al.: "Z-Phenylacetaldoxime degradation by a novel aldoxime dehydratase from Bacillus sp.strain OxB-1" FEMS Microbiology Letters. (in press).