シグナル伝達を担うキナーゼの細胞内における活性測定法の開発と応用

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09770068
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 稲垣 直之 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (20223216)
• キーワード: シグナル伝達 / イメージング / CaMキナーゼII / リン酸化抗体 / Rho-キナーゼ / ビメンチン / 細胞内小器官 / dendritic spine

研究概要

1) カルシウムとCaMキナーゼIIによるシグナル伝達の同一細胞での活性測定法の開発
申請者は、これまでに細胞骨格蛋白質ビメンチンSer82のリン酸化をモニターするモノクローナル抗体を作成し細胞内のCaMキナーゼIIの活性を測定する方法を確立している。今回、この方法とカルシウム顕微鏡を組み合わせることにより同一細胞におけるカルシウムとCaMキナーゼIIによるシグナル伝達を可視化することに成功した。その結果カルシウムシグナルの細胞内分布がCaMキナーゼIIのシグナル伝達の細胞内分布を限定することがわかった。このことからカルシウムシグナルが細胞内において空間的な情報として下流分子へ伝わることが示唆された。
2) CaMキナーゼIIとRho-キナーゼの細胞質、細胞膜、核、シナプスにおけるシグナル伝達の可視化法の開発
ビメンチンのヘッドドメインにシグナルペプチドを付けて細胞内の細胞質、細胞膜、核に発現させ、それを基質として細胞内小器官に特異的なCaMキナーゼIIとRho-キナーゼ活性をイメージングすることに成功した。この方法を用いてNMDA受容体の活性化により海馬ニューロンの後シナプスdendritic spineに限局したCaMキナーゼIIのシグナリングが起こることを証明した。CaMキナーゼIIはLTPなどのシナプスの可塑性に関与すると考えられており、このことから、後シナプスdendritic spineに限局したシナプス伝導の調節が行われる可能性が示唆された。
3) Cdc2キナーゼによるビメンチンリン酸化モニターを応用した発生脳における分裂グリア細胞の同定
ビメンチンは胎生15日から生後15日のラット脳においてグリア細胞に特異的に発現し、ニューロンでは認められない。また、Cdc2キナーゼは分裂細胞に特異的に活性化される。申請者はこれを応用し、Cdc2キナーゼによってリン酸化されたビメンチンを特異的に認識するモノクローナル抗体をもちいて発生脳における分裂グリア細胞の同定に成功した。

研究成果

• [文献書誌] Inagaki,N.et al.: "Spatial patterns of Ca2+ signals define intracellular distribution of a Signaling by Ca2+/calmoduliin-dependent protein kinase II" J.Biol.Chem.272. 25195-25199 (1997)
• [文献書誌] Inagaki,N.et al.: "Miosin binding subunit of smooth muscle myosin phosphatase at the cell-cell adhesion sites in MDCK cells" Biochem.Biophys.Res.Commun.230. 552-556 (1997)
• [文献書誌] Inagaki,M.et al.: "Phosphorylation-dependent control of intermediate filament structure: a novel approach using site-and phosphorylation state-specific antibodies" J.Biochem.121. 407-414 (1997)
• [文献書誌] Meijer,L.et al.: "Biochemical and cellular effects of roscovine,a potent and selective inhibitor of the cyclin-dependent kinases cdc2,cdk2 and cdk5" Eur.J.Biochem.243. 527-536 (1997)
• [文献書誌] Matsuzawa,K.et al.: "Domain specific phosphorylation of vimentin and glial fibrillary acidic protein by PKN" Biochem.Biophys.Res.Commun.234. 621-625 (1997)
• [文献書誌] Ito,M.et al.: "Interaction of smooth muscle myosin phosphatase with phospholipids." Biochemistry. 36. 7607-7614 (1997)
• [文献書誌] Kamei,Y.et al.: "Visualization of mitotic radila glial lineage cells in the developing rat brain by cdc2 kinase-phosphorylated vimentin" Glia. 23. 191-199 (1998)
• [文献書誌] Takizawa,N.et al.: "Alterations in type-1 serine/threonine protein phosphatase PP1a in response to B-cell receptor stimulation" J.Biochem.122. 730-737 (1997)
• [文献書誌] Yasui,Y.et al.: "Roles of Rho-associated kinase in cytokinesis:mutation in Rho-associated kinase phosphorylatio sites impair cytokinetic segregation of glial filaments" J.Cell Biol.143. 1249-1258 (1998)
• [文献書誌] Matsuzawa,K.et al.: "Intermediate Filaments,Hermann H.and Harris J.R.(eds.)" Plenum, 423-435 (1998)