| 研究概要 |
●tyrosine hydroxylase cDNAのスクリーニング
tyrosine hydroxylase(TH)遺伝子exon 12,13をflankするprimer(5'-TTGACCCCAGACACAGCA-3',5'-GGTAGAATACAGCATGAA-3')でPCRを行い、PCR産物をrandom prime法でlabelingした。このprobeを用いて当研究室におけるラット脳cDNA libraryからTH cDNAを持つplaqueをplaque hydridizationにて選択した。
●retrovirus vectorへのTH cDNAの組み込み
TH cDNAにlacZ,neomycin-resistant gene(neo)をligationさせたMoloney murine leukemia virus由来のretrovirus vectorを作製した。作製したvectorをpackaging cell lineにlipofectionにより導入した後、G418(400μg/ml)を含む培地でvectorの感染したcloneを選択した。選択されたcloneの培養を継続し、retrovirus particleに富むmediumを得た。
●ラット胎児脳からのneural stem cellの回収
Sprague-Dawleyラットの胎生14日の胎児を取り出し、大脳皮質を分離し細胞を機械的にdissociateした。20ng/ml EGFを含むDMEMで細胞を培養し、neural stem cellがsphereを形成するのを確認した。NSE,GFAP,O4に対する抗体を用い染色しnegativeであることを確認し、これらの細胞がneural stem cellである可能性が高いと判断した。以上まで、本実験は終了している。今後、これらの細胞に、retrovirusに組み込んだTH cDNAを導入する過程に入る予定である。
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