| 研究概要 |
冠微小血管内皮細胞においてAngIIの刺激により発現調節されるmRNAの同定
(1)冠微小血管内皮細胞(CMEC)の単離・培養:雄ウィスター・ラットの心臓より西田らの方法に準じたCMECの純培養系を樹立した。Acetylated LDLの取り込みによりCMECであることが確認された。
(2)AngII受容体を介する刺激:コンフルエントとなったCMECにAngIIを添加、12および24時間後にGTC法により細胞からRNAを抽出、以下の実験に供した。
(3)differential display法によるmRNA発現量の比較:differential display法では、4種のオリゴ(dT)プライマー(T12VG,T12VA,T12VT,T12VC(VにG,A,Cの各塩基を組み込んだ混合プライマー)を用い、RNA逆転写反応およびそれに引き続くPCRを行った。PCR産物を6%ポリアクリルアミドゲルに展開・乾燥後、オートラジオグラフィーを行い、PCR産物間での発現量の差異を比較した。(2)で得られたAngII添加・非添加群間の比較において、発現量の異なるバンドが4種得られた。
(4)特定遺伝子の同定・クローニング(3)で発現に変化の見られたバンドを切り出し、核酸を熱処理による抽出を行った。再度、同じプライマーの組合せでPCRを行い、産物をTAベクターにサブクローニングした。サブクローンの塩基配列を一部決定し、これをプローブとしてザンブロットを行ったところ、2種のクローンにおいて、RNAの発現の差異が確認された。現在、その2種のクローンの全遺伝子構造の解析を進めているが、確認された部位は既存の遺伝子と異なり、全く未知の遺伝子であることが予想される。
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