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(1)ラット血管平滑筋細胞の培養法の確立:
雄性Wistar-Kyoto系ラットより無菌的に胸部大動脈を摘出し、酵素分散法により中膜血管平滑筋細胞(VSMC)を初代培養した。これを継代培養し以下の実験に供した。
(2)培養VSMCにおけるホスホリパーゼC(PLC)活性・ホスホリパーゼD(PLD)活性の測定系の確立:
^3[H]イノシトールでラベルしたVSMCに、アンジオテンシンIIあるいは過酸化バナジン酸で刺激を加えた後の^3[H]イノシトール三リン酸産生をイオン交換樹脂クロマトグラフィー法を用いて測定し、VSMCにおけるPLC活性の指標とする系を確立した。またアンジオテンシンIIあるいは過酸化バナジン酸によるPLD活性化能を、^3[H]パルミチン酸でラベルしたVSMCの^3[H]フォスファチジルブタノール産生を薄層クロマトグラフィー法を用いて測定する系を確立した。
(3)培養VSMCの各種刺激時の細胞増殖・細胞肥大の検討:
10%血清・アンジオテンシンII・過酸化バナジン酸刺激時の^3[H]チミジン・^3[H]ロイシン取り込み能を測定し、VSMCの増殖・肥大をそれぞれ検討する系を確立した。
(4)RhoAアンチセンス組み換えアデノウイルスの作成:マウスRhoAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(as-ODN)・センスオリゴヌクレオチド(s-ODN)およびas-ODNのスクランブルオリゴヌクレオチド(scr-ODN)を各3組作成した。現在、サイトメガロウイルスエンハンサーとβアクチンプロモーターからなるCAプロモーターを持つアデノウイルスベクターpAdexCA1wに、RhoAに対するas-ODN・s-ODN・scr-ODNを組み換えたアデノウイルスを作成中である。
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