β-lactoglobulin抗原に対するミルクアレルギー患者T細胞応答の解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09770539
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 伊上 良輔 岐阜大学, 医学部・附属病院, 助手 (60273132)
• キーワード: ミルクアレルギー / 抗原 / β-lactoglibolin / T細胞 / HLA / クラスII / エピトープ

研究概要

1)β-lactoglobilinペプチドの合成
β-lactoglobilinのアミノ酸配列に従い、オーバーラッピングペプチドを合成した。合成は、Fmoc-strategyに基づきシステムPSSM-8(Shimazu)によって施行した。全ての合成ペプチドは、C18カラムを使用した逆相HPLC(Millipore)により精製した。
2)HLAタイピング
HLAクラスII(DR.DQ.DP)対立遺伝子のタイピングは第11回International Histocompatibility Workshopにおいて施行された方法に基づき、PCR-SSOP法によって行った。
3)ミルクアレルギー患者における免疫学的検討
10名のミルクアレルギー患者について免疫学的検討を行った。ミルクアレルギーの診断は、詳細な病歴聴取、臨床症状、皮内テスト、抗原除去試験、抗原負荷試験、および抗原特異的lgE抗体価を参考にした。血清免疫グロブリン値の測定と共に、ヒスタミン遊離試験、リンパ球幼若化反応、各種サイトカイン産生能などに関する検討を行った。
4)抗原特異的T細胞株の樹立
ミルクアレルギー患者より末梢血単核球(PBMC)を分離して、β-lactoglobilin特異的T細胞クローンを樹立した。PBMC(1×10^5/well)をオーバーラッピングβ-lactoglobilin粗抗原と共に96穴プレートで培養し、7日後にリンパ芽球を認めるwellにX線照射(3,000cGy)した自己のPBMC(1.5×10^5/well)とβ-lactoglobilinペプチド混合物(0.1μM),rhlL-2(50U/ml),rhlL-4(10U/ml)を加え、更に7日間培養してβ-lactoglobilin特異的T細胞株を得た。これまでに樹立できた細胞株は3株であった。これらのT細胞株をTerasakiプレートを用いた限界希釈法によりクローン化した。患者2名から各々1クローンづつ樹立した。7日後に、増殖良好なwellの細胞を96穴プレートへ、更にその後24穴プレートへと移して培養した。
5)T細胞の抗原特異的増殖反応
T細胞の抗原特異的増殖反応は96穴プレートを用いて、T細胞(3×10^4/well)、放射線照射PBMC(1×10^5/well)及びβ-lactoglobilinペプチド(0.1μM)を共培養し、72時間後の(^3H)TdRの取り込みで定量した。合計5つのT細胞エピトープが認められたが、各細胞株では別々のパターンが認められた。
T細胞およびクローンの抗原提示HLA分子を同定するために、抗HLAモノクローナル抗体を培養系に添加してT細胞応答への影響を調べたところ、HLA DR分子の関与がより強く認められた。

研究成果

• [文献書誌] Naomi Kondo, Ryosuke Inoue, et al.: "Iligh sensitivity and specificity of proliferative responses of lymphocytes to food antigens for detection of the offending food in patients with food-sensitive atopic dermatitis." Pediatric Asthma, Allergy, & Immunology. 10(4). 175-180 (1996)
• [文献書誌] Ryosuke Inoue, et al.: "Identification of Dermatophagoides farinae-2-derived peptides and class II HLA molecules recognized by T cells from atopic individuals." International Archives of Allergy and Immunology. 114. 354-360 (1997)
• [文献書誌] H.Kaneko, R.Inoue, et al.: "Two Japanese siblings with Bloom syndrome gene mutation and B cell lymphoma." Leukemia and Lymphoma. 27. 539-542 (1997)
• [文献書誌] Naomi Kondo, Ryosuke Inoue, et al.: "Inhibition of interferon-γ production from lymphocytes stimulated with food antigens by a β_2-agonist,procaterol,in patients with food-sensitive atopic dermatitis." Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 7(4). 225-228 (1997)
• [文献書誌] Hideo Kaneko, Ryosuke Inoue, et al.: "Management of malignant lymphoma in two siblings with Bloom's syndrome." Oncology Reports. 4. 1281-1283 (1997)