| 研究概要 |
1,ヒトヒスチダーゼの発現については,バキュロウイルスをもちいることにより組み換え体ヒトヒスチダーゼを調整することができた。現在、この組み換え体を家兎に感作し、抗ヒトヒスチダーゼ抗体を作成している。
2,毛根細胞および表皮細胞内のヒスチダーゼ活性を測定するために、両者の細胞培養を試みた。両者とも初代培養後3週間を経過した時点では良好に細胞は観察されなかった。そこで、表皮細胞内のヒスチダーゼ活性測定は培養細胞を用いることなく、組織内、とりわけ試料入手が比較的簡単な爪組織内のヒスチダーゼ活性測定をHPLCを用いて直接測定することとした。具体的なヒスチダーゼ活性測定法は以下の通りである。
(1)tubeに採取した爪と精製水を入れソニケータで洗浄し、その後凍結乾燥機で乾燥させる。
(2)液体窒素で爪を冷却し爪粉砕器によって均一に細かく粉砕する。
(3)酵素反応は、爪、Distilled Water、0.1M Na_2CO_3-NaHCO_3 buffer,pH9.2をtubeに入れ、incubateする。3時間後に遠心分離し、その上清をHPLC測定する[0hr.]。残りの爪のtubeに87.5mMHistidine加え、incubateする。3時間後に遠心分離し、その上清をHPLC測定する[3hr]。
(4)3hr.後のUCAと0hr.のUCAを比較することにより、ヒスチダーゼ活性を測定することができた。
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