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昨年度コラーゲンa2鎖のプロモーター領域を有するCATプラスミド(COL1A2-CAT)及びその切断変異を強皮症線維芽細胞と正常線維芽細胞にtransfectして強皮症線維芽細胞におけるプロモーター活性化が消失する領域の同定を試みたが、各実験間および強皮症線維芽細胞と正常線維芽細胞間のtransfectionの効率のばらつきが大きく、transfectionの効率を全体的に上昇させる目的でlipofectinを用いた高効率の方法に切り替えて同様の検討を行なった。これによりtransfectionの効率は全体に上昇したものの、結局結果のばらつきは避けられなかった。したがってdeletion analysisのみによりプロモーター上の責任領域を同定することには限界があると思われ、他のassay系により関与する転写因子をある程度絞り込んだ上でsite-specific mutantの作成による検討を行なわねば安定した結果を得ることは困難ではないかと考えられた。しかし、この方向の検討も関与する転写因子が全く未知のものである場合には無効であり、さらに多様な方向からの検討が必要と思われる。
また昨年度、強皮症線維芽細胞の核抽出液において正常に比してより強いNF-kB consensussequenceへの結合能が認められた。そこで、コラーゲンa2鎖プロモーター領域上でNF-kBconsensus sequenceと類似の配列を検索したが、通常のstringencyでの検索では本研究で検討している配列上にはconsensus sequence類似の配列が存在しなかった。consensusの配列が存在しなくても実際には結合する可能性はあり、NF-kBを直接コラーゲンa2鎖プロモーターのoligonucleotideに結合させて検討することを計画している。
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