| 研究概要 |
まず、形成外科手術時に得られた正常ヒト皮膚より培養表皮角化細胞を樹立した。細胞老化の開始しない3passage以内のものを後の実験に供した。細胞が、ほぼconfluentになった時点で細胞が遊離しない低濃度のトロンビンもしくはトリプシンを加えさらに培養を続けた。経時的に細胞を回収し、全RNAを抽出した。このRNAをReverse transcriptaseにより相補的DNA(cDNA)に変換し、このcDNAを鋳型とし、各種サイトカインのprimerを用いて、サイトカインcDNAをPCR法により増幅させ、PCR産物はagarose電気泳動により分離し、etidium bromide染色後、紫外線により検出した。この結果、interleukin(IL)-1α,IL-1β,IL-3,IL-7,IL-8,IL-10,IL-11,IL-12p35,IL-12p40,transforming growth factor(TGF)-α,TGF-b,tumor necrosis factor-αに関しては発現の誘導もしくは増強を認めなかったが、IL-6および granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)については発現の誘導が確認された。Northern blot法によりmRNA量の変化が確実におこっていることをさらに確認した。トロンビンおよびトリプシンによりIL-6およびGM-CSFのmRNA発現が選択的に誘導されることから、これらサイトカインに関して、RNA回収時に得られた培養上清中のサイトカイン分泌量をELISA法により測定し、そのサイトカインが蛋白レベルでも発現されているかをを調べた。分泌量をマイクロプレートリーダーを用いて吸光度として測定し、標準物質を用いた系によって得られた検量線と比較することで定量化したところ、GM-CSFに関しては、これら蛋白分解酵素はその濃度依存性に、分泌量を増加させることが判明した。しかし、IL-6については、細胞の付着性が影響を受ける高濃度においてのみ検出された。
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