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伴性低リン血性ビタミンD抵抗性クル病(XLH)は、腎近位尿細管におけるリン再吸収障害による著しい低リン血症やビタミンDの代謝異常を呈する疾患である。近年、XLHの原因遺伝子PEXが同定され、PEX蛋白はリン輸送を制御する新たなリン調節ホルモン(フォスファトニン)の分泌に関わるプロセシング酵素と考えられている。そこで本研究では、フォスファトニンの同定を行うため、以下のような検討を行った。
1.安定性細胞株(OK2400 細胞)の樹立
ヒトNa依存性リン輸送担体(NaPi-3)遺伝子の転写開始点上流2.4kbをルシフェラーゼ遺伝子をもつリポーターベクターに連結し、腎尿細管由来のOK細胞にトランスフェクションした。その後48時間正常およびXLH患者血清存在下で培養した後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターにて測定した。血清5%添加では、有意差が認められなかったが、20%まで増加させると明らかにXLH患者血清でルシフェラーゼ活性が抑制された。
2.PEX特異抗体の作成
PEX遺伝子が同定され、エンドペプチダーゼと考えられているが、その機能は未だ不明である。そこで、PEX蛋白の機能を検討するため、特異抗体の作成を行った。PEXのアミノ酸配列を元に合成したペプチドによる抗体作成中、免疫動物であるウサギの血中リン濃度が著しく低下したため、抗体作成に伴うPEXの不活性化が考えられた。そこで、抗血清をOK2400細胞に添加し、同様にルシフェラーゼ活性を測定した結果、20%添加によりコントロールと比較して明らかにルシフェラーゼ活性が抑制された。さらに抗血清の熱処理により活性は上昇した。
本研究によるフォスファトニン検出システムは、大量の患者血清を必要するため、困難であった。しかし、抗血清が利用できるとなれば、同定が可能となる。現在、組み替えPEXを発現させ、特異抗体の確認を行っている。
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