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発現ベクターh-RAGE-pcDNAampの機能が不安定なため、新たに、h-RAGE発現ベクターを作成した(hRAGE-pSI)。又、IL6 promoterリポータープラスミドの感受性が低いため、TK-promoterにNFKBsiteを6カ所接続したluciferaseリポータープラスミド(6xNFKB-luc)を入手した。
humanRAGEの機能確認
wild-typeのcos細胞に6xNFKB-lucを導入しAGE-BSAを作用させたところNFKBが活性化した。各種細胞で同様の検討を試みたところ、Hela細胞、メサンギウム細胞ではAGE-BSAによりNFKBが活性化したが、HepG2細胞ではAGE-BSAによるNFKBの活性化は認めなかった。現在、wild typeのHepG2細胞におけるh-RAGEの発現をwestern blotで検討するとともに、RAGE蛋白質の過剰発現によりAGE-BSAによるNFKB活性化が起こるか否かを検討している。
メサンギウム細胞におけるRAGEの発現調整とそれに伴うAGE感受性の検討
メサンギウム細胞でh-RAGEのmRNAの発現をRT-PCRにて確認したが、western blotでは、抗体のaffinity purifyなどにもかかわらず、有意なバンドを確認できていない。膜画分によるwestern blotならびに、細胞膜蛋白を細胞外よりビオチン化による細胞膜上のRAGE発現量の定量化を試みたい。また、メサンギウム細胞におけるAGE-BSAによるNFKBの活性化へのRAGEの関与を確認するため、anti-sense h-RAGEの発現プラスミドを用て検討している。又、6xNFKB-lucをメサンギウム細胞に導入し、各種体液性因子がAGE-BSAにによるNFKBの活性化に与える影響を検討中である。
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