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1. 申請者らが固定した新規骨形成タンパク質BMP-3bの機能解明を目的にリコンビナントタンパク質を調製を試みた。
(1) リコンビナントタンパク質の精製
従来の方法でのリコンビナントタンパク質の取得では、発現量とプロセシング効率が悪く(8lの培養上清から50μg)、実用的な実験検討が困難であったので、新たな調製方法を検討した。その結果、同族のBMP-2のプロ体とBMP-3bの成熟体部分を結合させ、さらに、プロセス部位直後にFLAGを結合したキメラタンパク質をコードする発現ベクターが最適であった。このベクターをCHO細胞にトランスフェクションし、血清含有培地にてリコンビナントタンパク質を分泌させると、極めて効率的にしかも容易にリコンビナントタンパク質が得られた(8lの培養上清から0.8mg)。
(2) リコンビナントタンパク質の確認
リコンビナントタンパク質100ngをウエスタンブロッティングにて検出したところ、予想通り、13kDの大きさのBMP-3bであることを確認した。また、ブロットしたタンパク質のN末端配列解析からも、予想された位置でプロセシングされたBMP-3bであることを確認した。
2. 初代骨芽細胞培養系におけるBMP-3b遺伝子の発現調節の検討を行ったところ、以下のような結果を得た。
(1) BMP-3b遺伝子の発現は、株化している骨芽細胞様細胞では検出できなかったが、分化状態を維持している初代培養骨芽細胞においては、多量に発現していることを確認した。
(2) BMP-3b遺伝子の発現量は、初代培養骨芽細胞の長期培養による分化の進行状態(アルカリカリフォスファターゼ活性の増加及び石灰化を伴う)に応じて、顕著に増加した。
(3) また、BMP-3b遺伝子は、初代培養骨芽細胞をBMP-2(骨形成促進因子)で刺激することにより(アルカリカリフォスファターゼ活性及び石灰化が亢進する)、その発現量が約7倍に増加した。
(4) 一方、増殖因子であるTGF-β1での刺激により(アルカリフォスファターゼ活性及び石灰化が強力に抑制される)、BMP-3b遺伝子発現は、迅速かつほぼ完全に抑制された。
以上の結果より、BMP-3bは、高度に分化した骨芽細胞において、重要な機能を有するタンパク質であることが示唆された。
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