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低酸素状態による胎児新生児脳神経細胞障害におけるカルパインの動態を検討するために、神経培養細胞(GOTO:neuroblastoma cell line)とラット胎児脳神経初代培養細胞を用いて以下の実験を行い結果を得た。
1、μ-及びm-カルパインの不活性前駆体型に対するベプチド抗体を作製した。
2、神経細胞培養系の培養液の低酸素化(約20%)を酸素分圧測定器で確認した。
3、低酸素培養による神経細胞内カルシウム濃度の増加(約0.7-1.0μM)を蛍光顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡で確認した。
4、低酸素培養下におけるカルパインの動態をカルパインインヒビターの存在、非存在下でのトリパンブルーテストによる生細胞率の測定、上記抗体を用いたWestem blotting法、免疫組織染色によって検討した。
その結果、GOTO培養細胞及びラット胎児脳神経初代培養細胞において、低酸素処置によって生細胞数の減少が時間依存的に認められ、種々のカルパイン特異的インヒビターによって細胞死の抑制(回復)が認められた。
免疫組織染色法では上記抗体によって核に特異的な染色が認められ、その染色性は低酸素処置によって低下した。
Westem blotting法においても、同処理による上記抗体の染色性の低下が認められた。また、μ-カルパインのDomain-IIIに対する抗体によってμ-カルパインの活性化を示す染色性の低分子化が観察された。
5、妊娠19日Wisterラットをエーテル麻酔下に開腹し、片側の子宮動脈を20分間遮断後、胎仔脳を摘出し実験4と同様にWestern Blotting法、免疫組織染色法に供した。対側胎仔を対照とした。
その結果、Western blotting法で上記同様のμ-カルパインの活性化を示す結果が得られた。
また胎盤においても同様の結果が得られた。
以上より、神経細胞に存在するμ-カルパインが胎児新生児脳の低酸素状態による神経細胞障害において重要な役割を演じている事が示された。また、胎児胎盤系における低酸素状態においてもμ-カルパインが何らかの負の作用を演じている可能性が示唆された。
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