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Bisulfite シークエンス法は1994年Clarkらによって報告された、メチル化シトシンを同定するシークエンス法である。具体的には過剰メチル化を認めているGenomic DNAを、Sodium bisulfiteで処理し、PCRにて増幅すると、メチル化シトシンはシトシンとして増幅されるが、メチル化されていないシトシンはチミンとして増幅される。この違いを利用して、増幅したPCR断片のシークエンスを行い、メチル化部位を決定する方法である。今回この方法を用いてRB遺伝子5'領域の詳細なメチル化部位の同定を試みた。材料として、我々がこれまでサザンブロッティングにてRB遺伝子5'領域に過剰メチル化を見い出し、報告してきた網膜芽細胞腫のGenomic DNA4例を用いた。
その結果、4例中2例、Bisulfite シークエンス法にてRB遺伝子におけるメチル化部位を同定することに成功した。メチル化領域はサザンブロッティングの結果から予想された領域とほぼ一致していた。すべてのCpG部位にメチル化がおこっているわけではなかったが、2例ともRB遺伝子プロモーターにおいてプロモーター活性を制御しているRBF-1部位にはメチル化がおこっていた。以前我々は、in vitroでRBF-1部位のメチル化により、RBF-1タンパクがDNAに結合できなくなることを示し、また、RB遺伝子プロモーターのメチル化により、プロモーター活性が減少することを報告しており、今回の結果も、RBF-1部位のメチル化がRB遺伝子の発現の減少、癌化にかかわっている可能性を強く示唆している。
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