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sV40のミニ染色体を用いた無細胞ヌクレオチド除去修復系の精製因子による再構成を目指し、昨年度中に、裸のプラスミドDNAを用いた系により明らかにされている既知のヌクレオチド除去修復因子のうち反応の初期過程、即ちDNA鎖の切断までに必要な因子である、XPA、MPC-hHR23B、XPF-ERCC1、XPG、RPA、TFIIHを精製した。本年度は、これらの因子を用いて、反応系を再構成し、その反応機構について明らかにし、さらにヌクレオソーム構造上の損傷に特異的に要求される因子の検索を目的とした。
まず、精製因子による再構成を試みたところ、上記の因子により、裸のDNA上における修復反応に比べて効率は低いものの修復反応が再構成された。しかし、粗抽出液を分画して得た画分に比べ、特に、RPAについて、粗抽出液画分よりも精製酵素では、多量の蛋白質を添加する必要があった。この結果より、粗抽出液中には、RPAの活性化、もしくは、RPAと協調的に機能する未同定の因子が存在すると考えられる。現在、この因子の同定を試みている。
すでに、我々は、粗抽出液系を用いて、XPC-hHR23B複合体が、ヌクレオチド除去修復反応において最初に損傷DNAを認識する因子であることを示している。そこで、精製酵素による再構成系を用いて、各因子がどのような順番で反応に関与するかを調べた。その結果、XPC-hHR23B複合体が、やはり、最初に必要なこと、続いて、TFIIH複合体が、損傷DNAとXPC-hHR23Bとの複合体上へ導入されることを明らかにした。
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