| 研究概要 |
肝細胞増殖因子(HGF)の組織障害に応答した活性化機構はプロテアーゼの多段階カスケードを介するものであり,多様な生理作用を担うHGFとその受容体系の活性発現制御機構の解明は重要である。最近,HGFの局所的な活性発現を担うセリンプロテアーゼであるHGF activatorの2つの活性阻害因子(HAI)が申請者らにより単離され,HAIは膜結合性のKunitz型セリンプロテアーゼインヒビターであることが明らかになった。本研究ではこれら新しい阻害蛋白HAI1およびHAI2を対象として,HGFとその受容体系の活性発現制御のメカニズムを解明することを目的として,動物細胞を用いた発現系を作製し動物細胞でHAIを高発現させて回収し,その生化学的性質を調べた。
(1)Kunitzドメインが複数連続するTFPI等の阻害因子では,特定のドメインが必須な機能部位であることが報告されている。それぞれの阻害因子に存在する個々の機能ドメインを動物細胞で発現させ,各ドメインのHGF活性化制御における役割を調べた。遺伝子操作によりHAI1,HAI2に存在する機能ドメインの各所が欠失した変異蛋白を発現させ,個々の変異蛋白の生理活性を検討した。その結果,N末端側のKunitzドメインがHGF activatorの主要な相互作用領域であることが示された(manuscript in preparation)。さらに内在すると考えられる複数の分子種の阻害能の差異より,LDLドメインが阻害作用に対して調節的に働くことが示唆された。
(2)HAI1とHAI2は共にN末端側にシグナル配列,C末端側に膜結合ドメインと考えられる疎水領域をもつ一方,精製蛋白の生化学的性質よりそれら前駆体がプロセッシングされ分泌型が生成するものと考えられる。そこで膜結合型・分泌型分子の個々の発現細胞における局在様式を解析した。 HAI1,HAI2のそれぞれの抗体を作製し,細胞内分画法および抗体染色法を用いて発現細胞中における蛋白量の変化,分泌型/膜結合型の量比変化を比較検討した結果,HAIは膜結合型として存在し,プロセッシング酵素によって分泌型に変換するものと考えられる。さらに阻害剤特異性によりその分泌酵素はメタロプロテアーゼであるものと思われる(manuscript in preparation)。
今後は二種のHAIおよびそれらの膜結合領域欠損体のcDNAをGFPベクターに組み込み動物細胞中で発現させ,共焦点レーザー顕微鏡等を用いてin vivoでの遺伝子発現や蛋白質局在化を解析する。さらに,HAIが生体内で受容体蛋白として機能する可能性を検討する予定である。
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