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本研究は、蛋白質の折れ畳みに重要な相互作用の種類を明らかにするために、二量化したアポミオグロビンの折れ畳み過程を調べ、単量体と比較することを目的としている。本年度は、実験に必要な装置の開発と試料の作成を行った。また、折れ畳みをモニターする手段として蛍光消光を使うための基礎的なデータの収集を行った。
1)折れ畳みを観察する高速反応装置の開発。1ms以内に起こる折れ畳み過程を観察するための高速反応セルを制作した。このセルを使ってCDスペクトルを測定する努力を現在続けている。また、このセルを使い蛍光変化を測定する装置も開発中である。
2)蛍光を発するトリプトファン残基(Trp)を蛋白中の任意の位置に埋め込むことで、折れ畳みが蛋白のどの場所で進んでいるかを推定することができる。その第一段階として、ミオグロビンに含まれる二つのTrpのうち、片方をフェニルアラニンに置換した変異体を作成し蛍光スペクトルの野生型との違いを検討した。
3)折れ畳み途中にある蛋白質は揺らぎが大きく、構造を調べることが難しい。本研究では溶液中に加えた塩による蛍光消光を指標にしてTrp周囲の構造を推定できると考え、アポミオグロビンの天然状態と変性状態、モルテングロビュール状態の蛍光消光速度の比較を行った。消光速度は溶液の条件に依存するが、Trp単体の消光速度と比較することで、蛋白質中にあるTrp残基が溶媒から保護される度合いを見積もることができる。本研究ではこれを初めて示し、保護因子という新しい量を定義した。更に、モルテングロビュール状態が、少なくとも二つの性質の異なる状態から成ることを明らかにした。
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