1997 年度実績報告書

小脳プルキンエ細胞樹状突起分岐形成に関与する遺伝子群の単離と機能解析

研究課題

研究課題/領域番号	09780733
研究機関	理化学研究所
研究代表者	古屋茂樹理化学研究所, 糖細胞情報研チーム, フロンティア研究員 (00222274)
キーワード	cDNA / サブトラクション
研究概要	本年度は申請者の得たこれまでの知見を踏まえ、プルキンエ細胞の樹状突起形成期に特異的なcDNAサブトラクトライブラリーの構築を目指した。まず、培養小脳神経細胞からのtotal RNAの抽出条件を検討した。種々の方法を用いたが、結果的に酸性グアニジン処理後、酸性フェノール抽出を行なうと最も効率よくtotal RNAを回収できた。しかし、初代培養系であることからRNAの回収量は少なく、従来の方法でcDNAライブラリーを合成するに充分なmRNAを集めることが困難であった。そのため、testerとdriverの細胞から調製したライブラリーを実際にハイブリダイズさせ、発現に差のないmRNAを除くphysical subtraction法によるcDNAライブラリー作製は断念せざるおえなかった。そこで、近年Diatchenkoらにより開発されたPCRを用いた方法を導入してcDNAサブトラクトライブラリーの作製を試みた。培養後7日と14日目の小脳初代培養神経細胞から調製したtotal RNAをそれぞれdriverとtesterにした。total RNAから逆転写反応後、PRCによってcDNAを合成し、さらにtester由来のcDNAにPCRによって増幅可能な配列を持つアダプターをライゲーションした。このcDNAにPCRによって増幅可能な配列を持つアダプターをライゲーションした。このcDNAをアダプターを持たないdriver由来cDNAとハイッブリダイズさせ、その後PCRによってdriver由来cDNAとハイブリダイズしていないtester特異的cDNA断片を増幅した。サブトラクション効率を、解糖系酵素であるG3PDHがPCRによってバンドが検出できるサイクル数から検定してみると、G3PDHをcDNA断片の存在比は、サブトラクション後では、サブトラクション前の少なくとも400倍に激減しており、この一連の操作によって樹状突起形成期特異的cDNA断片が濃縮しているものと予想された。今後このcDNAからライブラリーを調製後、testerおよびdriver cDNA断片をプローブとしてスクリーンし、樹状突起形成期特異的クローンの同定と塩基配列解析を行なう予定である。

研究成果

(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Furuya,S.et al.: "Ceramide and Its Interconvertable Metabolite Sphingosine Function as Indispensable Lipid Factors Involved in Survival and Dendritic Differentiation of Cerebellar Purkinje Cells." Journal of Neurochemistry. (in press). (1998)
[文献書誌] Mitoma,J.et al.: "A Novel Metabolic Communication between Neurons and Astrocytes : A Non-Essential Amino Acid L-Serine Is Trophic for Developing Hippocampal Neurons and Released by Astrocytes." Neuroscience Research. (in press). (1998)
[文献書誌] Yamane,Y.et al.: "Molecular Characterization of Xenopus Embryo Heparan Sulfate : Different Structural Requirements for the Specific Binding to Basic Fibroblast Growth Factor and Follistatin." Journal of Biological Chemistry. (in press). (1998)
[文献書誌] Mitoma,J.et al.: "Bipotential Role of Ceramide in the Growth of Hippocampal Neurons : Promotion of Cell Survival and Dendritic Elongation in Dose- and Developmental Stage-Dependent Manners." Journal of Neuroscience Research. (in press). (1998)
[文献書誌] Zhang,G.et al.: "Developmentally Regulated O-Acetylated Sialoglycans in the Central Nervous System Revealed by A New Monoclonal Antibody 493D4 Recognizing O-Acetylated Glycoconjugates." Glycoconjugate J.14. 847-857 (1997)
[文献書誌] 平林義雄, 古屋茂樹: "神経系スフィンゴ脂質の謎を解く." 蛋白質核酸酵素. 42. 2027-2038 (1997)

1997 年度 実績報告書

小脳プルキンエ細胞樹状突起分岐形成に関与する遺伝子群の単離と機能解析

研究代表者

古屋 茂樹 理化学研究所, 糖細胞情報研チーム, フロンティア研究員 (00222274)

研究成果

[文献書誌] Furuya,S.et al.: "Ceramide and Its Interconvertable Metabolite Sphingosine Function as Indispensable Lipid Factors Involved in Survival and Dendritic Differentiation of Cerebellar Purkinje Cells." Journal of Neurochemistry. (in press). (1998)

[文献書誌] Mitoma,J.et al.: "A Novel Metabolic Communication between Neurons and Astrocytes : A Non-Essential Amino Acid L-Serine Is Trophic for Developing Hippocampal Neurons and Released by Astrocytes." Neuroscience Research. (in press). (1998)

[文献書誌] Yamane,Y.et al.: "Molecular Characterization of Xenopus Embryo Heparan Sulfate : Different Structural Requirements for the Specific Binding to Basic Fibroblast Growth Factor and Follistatin." Journal of Biological Chemistry. (in press). (1998)

[文献書誌] Mitoma,J.et al.: "Bipotential Role of Ceramide in the Growth of Hippocampal Neurons : Promotion of Cell Survival and Dendritic Elongation in Dose- and Developmental Stage-Dependent Manners." Journal of Neuroscience Research. (in press). (1998)

[文献書誌] Zhang,G.et al.: "Developmentally Regulated O-Acetylated Sialoglycans in the Central Nervous System Revealed by A New Monoclonal Antibody 493D4 Recognizing O-Acetylated Glycoconjugates." Glycoconjugate J.14. 847-857 (1997)

[文献書誌] 平林義雄, 古屋茂樹: "神経系スフィンゴ脂質の謎を解く." 蛋白質 核酸 酵素. 42. 2027-2038 (1997)

1997 年度実績報告書

古屋茂樹理化学研究所, 糖細胞情報研チーム, フロンティア研究員 (00222274)

[文献書誌] 平林義雄, 古屋茂樹: "神経系スフィンゴ脂質の謎を解く." 蛋白質核酸酵素. 42. 2027-2038 (1997)