変異イェロープロテインを用いた光反応に必須なアミノ酸残基と高次構造の研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09833004
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 今元 泰 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (80263200)
• 研究分担者: 徳永 史生 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80025452)
• キーワード: 蛋白質高次構造 / フーリエ変換赤外分光法 / X線溶液散乱 / 吸収スペクトル / 光反応サイクル / フロトン移動 / 光反応サイクル / 中間体

研究概要

紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophilaに見出された水溶牲の光受容蛋白質であるPhotoactive yellow protein (PYP)は、高次構造が高分解能で解明されていることから、生物における光受答メカニズムを原子レベルで解明するために現在最も好適な蛋白質である。しかし、変異蛋白質の発現系がまだできていなかったために、アミノ酸レベルでの研究はさほど進んでいなかった。そこで本研究では、最近われわれが調製法を確立した変異PYPを用い、それらの吸収スペクトルの解析とフーリエ変換赤外分光法(FTIR)による水素結合ネットワークの解析を行った。
1.PYPの発色団は、Glu、Thr、Tyrと水素結合ネットワークを形成し、Argがこのネットワークを安定化している。これらの残基に変異を導入した変異体を作製し、それらのM中間体の崩壊速度を解析したところ、Y42A、E46Qでは野生型よりも速く、Y42F、E46A、T50A、T50V、R52Qでは遅くなった。そのため、各残基の水素結合の強さだけでなく、大きさも中間体の挙動に影響を与えていることが示された。
2.各中間体における発色団の水酸基とGlu46との間の水素結合の変化をFTIRで解析したところ、B、H、L中間体では水素結合が強くなっていたが、M中間体では水素結合はなくなっていた。そのため、M中間体で大きな構造変化が起こっていることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] K.Miharu et al.: "Functional expression and site-directed mutagenesis of photoactive yellow protein" J.Biochem.121. 876-880 (1997)
• [文献書誌] Y.Imamoto et al.: "Evidence for proton transfer from Glu-46 to the chromophore during the photocycle of photoactive yellow protein" J.Biol.Chem.272. 12905-l2908 (1997)
• [文献書誌] H.Chosrowjan et al.: "Femtosecond-picosecond fluorescence studies on excited state dynamics of photoactive yellow protein from Ectothiorhodospira halophila" Chem.Phys.Lett.270. 267-272 (1997)
• [文献書誌] H.Kamikubo et al.: "The last phase of the reprotonation switch in bacteriorhodopsin : the transition between the M-type and the N-type protein conformation depends on hydration." Biochemistry. 36. 12282-112287 (1997)
• [文献書誌] H.Imai et al: "Photochemical and biochemical properties of chicken blue-sensitive cone visual pigment" Biochemistry. 36. 12773-l2779 (1997)
• [文献書誌] S.Tachibanaki et al.: "Presence of two rhodopsin intermediates responsible for transducin activation" Biochemisty. 36. 14173-14180 (1997)