| 研究課題/領域番号 |
09877149
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
太田 秀臣 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (10112814)
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| 研究分担者 |
岡藤 隆夫 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (40266599)
南谷 幹之 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (00229775)
松島 宏 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70190460)
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| キーワード | 点頭てんかん / 遺伝子導入 / モデル動物 / 副腎皮質刺激ホルモン放出因子 |
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| 研究概要 |
点頭てんかんは乳児期にみられる最も悪質なてんかル発作である。点頭てんかんは臨床的に長い歴史をもつにもかかわらず、その成因や有効とされるACTH療法の作用機序に関しては不明である。近年、点頭てんかんは特異的な年齢において、脳内での副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRH)の過剰発現による神経系の異常興奮に基づくとの仮説が報告された。そこで、本研究では、この仮説を分子生物学的に解明することを試みる。
研究成果: ラット胎仔(E17〜19)の間脳部を切り出した後、パパイン/トリプシン酵素処理により細胞分散を行い、未分化神経細胞の初代培養系を樹立することを試みた。なお細胞をin vivoの状態に近づけるため、培養は我々の樹立したラット平滑筋細胞(R22Cl-F)によって産性された生物学的細胞外基質(R22Cl-F matrix)上にて行う。SV40-T抗原温度感受性変異体(tsA58)と遺伝子導入細胞選別のためのネオマイン耐性遺伝子とを同じベクター上に有する遺伝子発現ベクターをエレクトロポレーションてこの初代培養細胞中に導入した。ネオマイシン(0.8mg/ml)存在下、33℃で2週間培養した後、遺伝子導入細胞(コロニー)を抗-T抗体を用いた間接蛍光抗体法にて同定、クローニングすることを試みた。初代培養細胞は遺伝子導入に極めて脆弱であるため、不死化細胞を樹立することができなかった。このため、樹立未分化未分化神経細胞内へのCRHcDNA導入をおこなった。現在、得られた各クローンについて、CRH発現(産性)をCRHcDNAをプローブとしたノーザンブロット、抗-CRH抗体による免疫組織化学法、ラジオイッムノアッセイ(RIA)にてスクリーニングを行い、検討している。今後、この細胞をラット脳内へ移植し、CRH過剰産生モデル動物作成を行い、点頭てんかんモデル動物となりうるか否かを検討予定である。
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