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本年度はHRF研究の基本部分を確立する目的で、先ずヒトHRFの遺伝子全長をクローニングした。培養した正常皮膚線維芽細胞よりtotalRNAを抽出しcDNAライブラリにした後、既に報告されているp23のDNAシーケンスを基にHRF遺伝子を回収、確認した。これを一旦、pGEMベクターにサブクローニングし、インサート部分をNorthern hybridizationに用いるプローブとした。またこのインサートを一部改変しGST fusion vectorであるpGEX4Tに挿入、組み換え体としてHRFタンパクをバクテリアを用いて発現させ、グルタチオンカラムを用いて精製、回収した。
HRFの組織分布を知る目的で、各種ヒト細胞を用いその発現を検索した。皮膚線維芽細胞、セミノーマ細胞、乳癌細胞、表皮細胞、末梢血有核細胞、血管内皮細胞、Hela細胞、肝細胞の各々の細胞をcell lineから培養、または組織から回収し、totalRNAを抽出した。それを用いて各組織のHRFの発現をNorthern hybridization及びRT-PCRを用いて検討した。結果、全ての組織でほぼ同レベルで発現していた。またその発現量は比較的多く、internal controlに用いたG3PDHに匹敵しており、当初予定していたRNase protection assayを行う必要はなかった。以上より、HRFは生体組織の普遍的に発現していることが示唆された。このことは我々に、HRFがIgE依存性ヒスタミン遊離因子としてのみならず、細胞の基本構成成分としての重要な機能を有するとの新たな仮説をもたらした。
一方リコンビナントタンパクとしてHRFは現在動物に免疫され、抗体を作成している。
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