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外科術後に生じるTリンパ球の活性化をTh1/Th2理論から解析することを目的に本年度の研究を開始し、これまでにTh1/Th2細胞同定法の確率とその問題点の把握および健常成人6人、外科術後発熱患者5人を対象にしたcontrol studyを行った。その成績を以下に報告する。
1.フローサイトメトリーを用いた細胞内サイトカイン同定法
本法の最適条件として、T細胞刺激剤(PMA5μg/ml、Caイオノフォア1μM/l)、蛋白分泌抑制剤(NaイオノフォアであるMonensin2μM/l)の共存下に4.5-6時間培養した後、4%パラホルムアルデヒドで細胞固定を行う。続いて、0.1%Saponin溶液にて細胞膜透過性を亢進させ、細胞内に合成蓄積したサイトカインをモノクローナル抗体にて蛍光標識し、フローサイトメトリーによる解析を行う。なお、Th1のマーカーとしてはINF-γをTh2のマーカーとしてはIL-4を用いた。
2.本法の問題点と課題
(1)サイトカインの種類により至適条件が若干異なる。陽性率は上記の刺激ではINF-γ5時間、IL-4、IL-2は4時間がピークとなる。(2)抗サイトカイン抗体、各クローン間での差:当初予定していたIL-10は現存の抗体では検出できない。(3)4カラー解析が可能(2種類のサイトカインを同一細胞にて同時に解析する)だが、本法の手技(培養、活性化、染色)中に表面抗原CD4、CD45ROの発現に変化が生じる。(4)検査に要する時間:分離リンパ球では終了までに9時間を要するので、現在、全血法による短縮化を試作中である。
3.Control study成績(値は平均値)
(1)健常成人:フローサイトメトリーを用いた細胞内サイトカイン同定法によるとサイトカイン合成は末梢血中のCD4、CD8両細胞に認められる。Th1細胞(INF-γ陽性 CD4 11.4%、CD8 35.8%; IL-2陽性 CD4 23.3% CD8 4.5%)。Th2細胞(IL-4陽性 CD4 6.7% CD8 1.3%)。INF-γ産生細胞におけるmemory細胞の占める割合はCD4 89.7%、CD8 28.4%であり、IL-2+INF-γの両陽性細胞は2.4%以下であった。CD4陽性細胞はCD45RO(+)となる段階でTh1細胞としてプログラムされ、かつ、合成サイトカイン(IL-2、INF-γ)が異なる可能性がある。
(2)発熱患者:INF-γ、IL-2産生(Th1)細胞の減少とIL-4産生(Th2)細胞の増加(CD4陽性 15.4%、CD8陽性 10.5%)を認めた。
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