| 研究概要 |
平成9年度は,カリエスフリーの者とDMFTが10以上の者のボランティア(平均年齢20歳)から頬粘膜を採取し,DNAを抽出精製した後,HLA遺伝子のうちHLA-DRBのタイピングを行った。
1.非観血的DNA抽出法の確立
疫学調査で多数のサンプルを迅速に得るには,通常のDNA抽出のために用いている血液採取は困難である。また,近年,血液を介して感染するウイルス性疾患が知られるようになり,それらのウイルスによる汚染を防ぐためにも血液からのDNA抽出を避け,非観血的な方法を確立することにした。
そこで,綿棒を用いて実験協力者100名の頬粘膜を擦過し,その剥離細胞からプロティナーゼKとセントリコンを用いて,高速遠心分離と振盪機による方法でDNAの抽出を試みた。抽出したDNAの一部を紫外線吸収分光光度計を用いて,DNAの濃度を測定したところ,PCR(Polymerase Chain Reaction)法によるDNAの増幅に必要な量が全ての資料から得られた。
(HLA-DRBのダイビング)
抽出したDNAにDNA増幅試薬を加え,サーマルサ-キュラーを用いて,HLA(Human Leukocyte Antigen)-DRB領域をPCR反応35サイクルで増幅した。増幅したDNA断片は変性させた後,Hybridization solutionと混和し,29種類の非放射線捕獲プローベを持ったプローベストリップを加えて,ハイブリダイズした。ハイブリダイズ後,洗浄し,化学発色させた。コントロールラインより濃いブルーの発色ラインの番号をチャックし,アンプリコア判定用ソフトを用いてHLA-DRBアリルの判定を行った。
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